Luận Văn Tối ưu hóa các điều kiện sinh 2 tổng hợp phytase từ chủng nấm men Pichia pastoris GS115 tái tổ hợp m

MỞ ĐẦU


Phospho là nguyên tố thiết yếu cho sự tăng trưởng, phát triển và sinh sản của động vật. Tuy nhiên, có khoảng 60-75% phospho trong ngũ cốc và hạt dầu trong thức ăn của động vật tìm thấy ở dạng phytate (inositol hexaphosphat) hoặc acid phytic (myo-inositol-1,2,3,4,5,6-hexakisphosphoric acid). Động vật dạ dày một ngăn như gia cầm, lợn và cá không thể hấp thụ phospho trong phytate vì chúng không có enzyme phytase trong đường ruột. Do đó, phospho vô cơ được thêm vào thức ăn để đáp ứng yêu cầu. Ngoài ra, phospho ở dạng phytate trong thức ăn không được động vật hấp thu sẽ bị đào thải trong phân và phospho dư thừa trong phân bị rửa trôi theo luồng nước thải gây ra sự phát triển nhanh chóng của tảo và có thể ảnh hưởng đến lượng oxy trong nước, làm cho cá chết.
Phytase là một enzyme acid phosphohydrolase, xúc tác thủy phân acid phytic thành phosphate vô cơ và những dẫn xuất myo-inositol phosphate. Hoạt tính phytase trong vi sinh vật thường được tìm thấy nhiều nhất ở nấm mốc.
Phytase được quan tâm cho những ứng dụng công nghệ sinh học, đặc biệt giảm phytate trong thức ăn và nguyên liệu. Bổ sung phytase vào nguyên liệu thức ăn chăn nuôi sẽ làm tăng giá trị sinh học của phosphate, giảm ô nhiễm phospho trong những vùng chăn nuôi tập trung. Sự thủy phân acid phytic bằng enzyme sẽ không sinh ra những sản phẩm có độc tố. Như vậy, khai thác enzyme trong công nghiệp sẽ thân thiện với môi trường và sẽ hỗ trợ trong sự phát triển của những công nghệ mới.
Tuy nhiên, khả năng ứng dụng enzyme này để thương mại hóa không được khả thi trong nhiều năm, do hoạt tính thấp và giá thành cao khi sản xuất phytase theo phương pháp lên men truyền thống. Để tạo ra một lượng lớn phytase có hoạt tính cao, ổn định, không gây độc tố, có khả năng áp dụng trong sản xuất công nghiệp, các nhà nghiên cứu đã tiến hành nghiên cứu tạo dòng gen phytase từ vi sinh vật vào vector biểu hiện và biến nạp vào hệ thống biểu hiện chủ.
Trong những hệ thống biểu hiện thì Pichia pastoris được xem là có nhiều ưu thế trong việc biểu hiện enzyme phytase tái tổ hợp với năng suất cao và có khả năng chịu nhiệt tốt. Do vậy, chúng tôi tiến hành đề tài với mục đích tối ưu hóa các điều kiện sinh tổng hợp phytase từ chủng nấm men Pichia pastoris GS115 tái tổ hợp mang gen phyAI mã hóa cho enzyme phytase của Aspergillus ficuum.
Nội dung nghiên cứu của đề tài:
 Kiểm tra khả năng sinh tổng hợp phytase tái tổ hợp của nấm men Pichia
pastoris GS115-phyAI.
 Tối ưu hóa các điều kiện lên men cho quá trình sản xuất phytase tái tổ hợp:
 Khảo sát môi trường sản xuất phytase thích hợp cho Pichia pastoris GS115.
 Khảo sát tỉ lệ giống và thời gian sản xuất tối ưu cho quá trình sản xuất phytase.
 Khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung khoáng vào môi trường sản xuất phytase.
 Khảo sát nguồn cacbon và nồng độ glucose thích hợp.
 Khảo sát nguồn nitơ thích hợp.
 So sánh khả năng lên men sản xuất phytase của nấm men Pichia pastoris GS115 theo phương pháp nuôi cấy trên máy lắc và trong bình lên men có cánh khuấy.
 Định lượng protein theo phương pháp Bradford.
 Điện di SDS-PAGE của sản phẩm enzyme thu nhận.