Tiến Sĩ Tinh sạch và nghiên cứu đặc tính của cellulase tự nhiên và tạo cellulase tái tổ hợp từ nấm sợi tại V

LUẬN ÁN TIẾN SĨ
NĂM 2015
MỞ ĐẦU 1
1. Đặt vấn đề 1
2. Mục tiêu nghiên cứu 2
3. Nội dung nghiên cứu . 3
4. Những đóng góp mới của luận án . 3
5. Ý nghĩa khoa học thực tiễn của luận án 4
5.1. Ý nghĩa khoa học 4
5.2. Ý nghĩa thực tiễn . 4
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 5
1.1. Cellulase . 5
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại . 5
1.1.2. Cơ chất cellulose 7
1.1.3. Cấu trúc của cellulase 8
1.1.4. Tinh sạch và đánh giá tính chất của cellulase . 14
1.1.4.1. Tinh sạch cellulase 14
1.1.4.2. Tính chất của cellulase . 15
1.2. Ứng dụ ng củ a cellulase 18
1.2.1. Ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm . 18
1.2.2. Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi 19
1.2.3. Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ . 21
1.2.4. Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy 21
1.2.5. Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa và công nghệ xử lý
rác thải . 22
1.3. Nghiên cứu tạo cellulase tái tổ hợp 23
1.3.1. Biểu hiện gen mã hóa cellulase trong E. coli 23
1.3.2. Biểu hiện gen mã hóa cellulase trong nấm men . 24
1.3.3. Biểu hiện gen mã hóa cellulase trong Bacillus 25
1.3.4. Biểu hiện gen mã hóa cellulase trong nấm mốc . 25
1.3.5. Biểu hiện gen mã hóa cellulase trong động vật và thực vật . 26
1.3.5.1. Trong thực vật 26
1.3.5.2. Trong động vật . 27
1.3.6. Nghiên cứu cellulase và biểu hiện gen cellulase ở Việt Nam 27
1.4. Nấm Peniophora sp. và Aspergillus niger . 29
1.4.1. Peniophora sp . 29
1.4.2. Aspergillus niger 30
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 32
2.1. Vật liệu, hóa chất và địa điểm nghiên cứu . 32
2.1.1. Vật liệu 32
2.1.2. Hóa chất, dung dịch và môi trường thí nghiệm . 32
2.1.2.1. Hóa chất 33
2.1.2.2. Dung dịch và đệm 33
2.1.2.3. Môi trường . 33
2.1.3. Địa điểm nghiên cứu 33
2.2. Thiết bị thí nghiệm 33
2.3. Phương pháp nghiên cứu 34
2.3.1. Các phương pháp vi sinh vật . 34
2.3.2. Các phương pháp sinh học phân tử 34
2.3.2.1. Tách chiết DNA tổng số của nấm mốc 34
2.3.2.2. Tách chiết DNA tổng số nấm men . 35
2.3.2.3. Tách DNA plasmid 35
2.3.2.4. Cắt plasmid bằng enzyme giới hạn 35
2.3.2.5. Tinh sạch phân đoạn DNA . 36
2.3.2.6. Nhân bản gen bằng PCR 36
2.3.2.7. Phản ứng nối ghép gen . 37
2.3.3.8. Biến nạp bằng sốc nhiệt . 38
2.3.3.9. Biến nạp bằng xung điện 38
2.3.2.10. Giải trình tự nucleotide 39
2.3.3. Các phương pháp hóa sinh 39
2.3.3.1. Xác định hoạt tính cellulase theo đường kính thủy phân trên
đĩa thạch 39
2.3.3.2. Xác định hoạt độ cellulase . 40
2.3.3.3. Tinh sạch cellulase tự nhiên . 40
2.3.3.4. Tinh sạch protein tái tổ hợp . 41
2.3.3.5. Điện di gel polyacrylamide (PAGE) 41
2.3.2.6. Điện di SDS-PAGE nhuộm hoạt tính 42
2.3.2.7. Xác định hàm lượng protein tổng số 42
2.3.2.8. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố lý hóa lên hoạt tính
và độ bền của endoglucanase tự nhiên và tái tổ hợp 43
2.3.2.9. Xác định sản phẩm thủy phân bằng kỹ thuật TLC 44
2.4. Phương pháp xử lý số liệu 44
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU . 46
3.1. Tinh sạch và nghiên cứu đặc tính của cellulase tự nhiên từ nấm sợi tại
Việt Nam . 46
3.1.1. Tuyển chọn và phân loại chủng nấm sợi sinh tổng hợp cellulase . 46
3.1.2. Tối ưu điều kiện môi trường nuôi cấy sinh tổng hợp cellulase . 49
3.1.2.1. Thời gian nuôi cấy thích hợp . 49
3.1.2.2. Ảnh hưởng của pH ban đầu của môi trường và nhiệt độ nuôi cấy 50
3.1.2.3. Ảnh hưởng của chất cảm ứng 52
3.1.2.4. Ảnh hưởng của nồng độ dịch chiết khoai tây bổ sung 53 3.1.2.5. Ảnh hưởng của nguồn cacbon . 53
3.1.2.6. Ảnh hưởng của nguồn nitơ 55
3.1.2.7. Ảnh hưởng của một số nguồn khoáng . 56
3.1.2.8. So sánh khả năng sinh tổng hợp enzyme trong môi trường tối
ưu và chưa tối ưu 57
3.1.3. Tinh sạch và đánh giá tính chất cellulase của chủng Peniophora sp.
NDVN01 58
3.1.3.1. Tinh sạch cellulase . 58
3.1.3.2. Động học cơ chất của cellulase 59
3.1.3.3. Đặc hiệu cơ chất của cellulase . 61
3.1.3.4. Sản phẩm thủy phân cơ chất của cellulase 62
3.1.3.5. Nhiệt độ phản ứng tối ưu và độ bền nhiệt độ của endoglucanase . 63
3.1.3.6. pH phản ứng tối ưu và độ bền pH của endoglucanase 64
3.1.3.7. Ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt tính endoglucanase 65
3.1.3.8. Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ và chất tẩy rửa đến hoạt tính
endoglucanase 66
3.2. Nhân dòng và biểu hiện gen meglA từ chủng Aspergillus niger VTCCF021
trong Pichia pastoris 68
3.2.1. Nhân dòng gen meglA 69
3.2.2. Thiết kế vector biểu hiện meglA 72
3.2.3. Biểu hiện rmEglA trong P. pastoris GS115 73
3.2.3.1. Xây dựng hệ thống biểu hiện P. pastoris GS115/pPmeglA . 73
3.2.3.2. Sàng lọc các dòng P. pastoris GS115/pPmeglA sinh tổng hợp
rmEglA mạnh . 75
3.2.4. Tối ưu một số thành phần mội trường và điều kiện lên men sản xuất rmEglA 76
3.2.4.1. Lựa chọn môi trường thích hợp . 76
3.2.4.2. Nồng độ cao nấm men tối ưu . 76
3.2.4.3. Nồng độ peptone tối ưu . 77
3.2.4.4. pH ban đầu của môi trường . 78 3.2.4.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ . 79
3.2.4.6. Ảnh hưởng của nồng độ methanol cảm ứng 80
3.2.4.7. Ảnh hưởng của thời gian đến năng suất biểu hiện rmEglA . 80
3.2.4.8. So sánh năng suất biểu hiện rmEglA trong môi trường tối ưu
và chưa tối ưu 81
3.2.5. Tinh sạch rmEglA 82
3.2.6. Tính chất của rmEglA . 83
3.2.6.1. Động học cơ chất của rEglA 83
3.2.6.3. Xác định tính đặc hiệu cơ chất của rmEglA 85
3.2.6.4. Sản phẩm thủy phân của rmEglA 85
3.2.6.5. Nhiệt phản ứng tối ưu và độ bền nhiệt độ của rmEglA . 86
3.2.6.6. pH phản ứng tối ưu và độ bền pH của rmEglA . 87
3.2.6.7. Ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt tính của rmEglA 88
3.2.6.8. Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ và chất tẩy rửa 89
Chương 4. THẢO LUẬN . 92
4.1. Tinh sạch và nghiên cứu đặc tính của cellulase tự nhiên từ nấm sợi tại
Việt Nam . 92
4.2. Nhân dòng và biểu hiện gen meglA từ chủng Aspergillus niger VTCCF021
trong Pichia pastoris 99


KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 103
Kết luận 103
Đề nghị . 104
CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 105
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 105



PHỤ LỤC 128
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học hiện đại, công nghệ enzyme
đã có bước phát triển vượt bậc, ngày càng có nhiều thành tựu và được ứng dụng
rộng rãi trong nhiều ngành công nghịêp, đem lại lợi ích to lớn cho con người.
Trong số các enzyme đang được ứng dụng hiện nay, cellulase là một trong
những enzyme có nhiều ứng dụng trong thực tiễn. Cellulase xúc tác cho phản
ứng thủy phân liên kết β-1,4-glycoside trong phân tử cellulose và các dẫn xuất
tạo thành glucose và các đường đơn giản. Do đó, cellulase được ứng dụng trong
công nghiệp thực phẩm, sản xuất thức ăn chăn nuôi, sản xuất bia, bột giấy,
ngành công nghiệp chất tẩy rửa, ngành công nghiệp dệt may, nhiên liệu và hóa
chất, quản lý chất thải và xử lý ô nhiễm môi trường.
Cellulase là một phức hệ enzyme gồm 3 loại enzyme chính gồm:
endoglucanase, exoglucanase và -glucosidase. Trong đó, endoglucanase là
loại enzyme có khả năng thủy phân mạnh phân tử cellulose ở vùng vô định
hình, có nhiều tiềm năng ứng dụng trong thực tiễn và được tập trung nghiên
cứu nhiều nhất hiện nay. Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về cellulase,
những nghiên cứu về cellulase chủ yếu tập trung vào việc tách dòng gen mã
hoá cellulase, tinh sạch và nghiên cứu đặc điểm hoá sinh của cellulase, tối ưu
những điều kiện nuôi cấy thu nhận chế phẩm enzyme từ các loài nấm mốc, vi
khuẩn và xạ khuẩn. Nhiều công ty trên thế giới đã tạo ra những chế phẩm
cellulase thương mại và ứng dụng vào thực tiễn. Ở Việt Nam đã có những
nghiên cứu về tinh sạch, nghiên cứu đặc điểm hoá sinh từ một số chủng nấm
sợi như: Penicillium, Aspergillus, Trichoderma; xạ khuẩn Actinomyces được
công bố. Tuy nhiên, việc khai thác ứng dụng cellulase từ nguồn tự nhiên gặp
nhiều hạn chế do năng lực sinh tổng hợp của chủng giống, không chủ động
nguồn enzyme, khó can thiệp thay đổi tính chất về động học enzyme, độ bền nhiệt độ và pH, khả năng hoạt động trong những điều kiện nồng độ cao chất
tẩy rửa và dung môi hữu cơ.
Bằng các kỹ thuật tái tổ hợp DNA đã cho phép các nhà công nghệ sinh học
phân lập và khuếch đại một gen đơn từ hệ gen của một sinh vật để có thể nghiên
cứu, biến đổi và chuyển nó vào cơ thể sinh vật khác tạo protein tái tổ hợp. Sản
xuất enzyme bằng con đường tái tổ hợp có thể chủ độ ng về nguồ n nguyên liệ u
cung cấ p enzyme ban đầ u ; nâng cao năng suấ t , chấ t lượ ng enzyme ; dễ dà ng
công nghệ hó a quá trì nh sả n xuấ t và giả m giá thà nh sả n phẩ m.
Trên thế giới, đã có nhiều phương pháp được đưa ra để nâng cao năng suất
cellulase như là tuyển chọn các chủng có khả năng sinh tổng hợp cellulase cao,
tối ưu hóa các điều kiện lên men nhằm thu được lượng lớn enzyme này. Đặc biệt
với sự phát triển của công nghệ, một số gen mã hóa cellulase của vi sinh vật và
thực vật đã được tách dòng và biểu hiện ở các hệ biểu hiện khác nhau (biểu hiện
ở E. coli, nấm men, nấm sợi). Ở Việt Nam, việc nghiên cứu cellulase chủ yếu
dừng ở việc phân lập tuyển chọn các chủng vi sinh vật sản xuất enzyme cao và
đánh giá một số tính chất của enzyme để ứng dụng trong công nghệ sinh học và
xử lý môi trường. Việc nghiên cứu tạo chế phẩm cellulase tái tổ hợp và ứng
dụng các chế phẩm này còn hạn chế.
Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:
“Tinh sạch và nghiên cứu đặc tính của cellulase tự nhiên và tạo
cellulase tái tổ hợp từ nấm sợi tại Việt Nam”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
(i) Tinh sạch và đánh giá được đặc tính của cellulase tự nhiên từ chủng
nấm sợi tuyển chọn;
(ii) Tạo được endoglucanase tái tổ hợp không chứa peptide tín hiệu từ
nguồn gen đã được phân lập từ chủng nấm sợi tuyển chọn tại Việt Nam.