Luận Văn Tinh sạch enzyme bromelain từ thân dứa (Ananas comosus (L.) Merr.) bằng phương pháp sắc ký trao đổi

TÓM TẮT


NGUYỄN THANH ĐIỀN, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 08/2006.


TINH SẠCH ENZYME BROMELAIN TỪ THÂN DỨA (Ananas comosus (L.) Merr.)


BẰNG PHưƠNG PHÁP SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION


GVHD: TS. BÙI MINH TRÍ


Bromelain thân (EC 3.4.22.33) là một trong các enzyme cystein proteinase được tìm


thấy nhiều nhất trong dứa (Ananas comosus (L.) Merr.). Các enzyme này được áp


dụng rộng rãi trong công nghiệp và trong y dược. Bromelain có ba hoạt tính khác


nhau: peptidase, amidase, esterase. Trong đó đặc biệt bromelain thân có thể phân hủy


cả cơ chất tự nhiên lẫn cơ chất tổng hợp. Chúng là enzyme có giá trị kinh tế và hầu hết


sản phẩm bromelain thương mại được ly trích từ thân dứa. Do đó yêu cầu bức thiết


được đặt ra là cần có một sản phẩm bột bromelain tinh sạch thuận lợi cho sử dụng, vận


chuyển, tồn trữ. Những kết quả nghiên cứu bước đầu trong tinh sạch bromelain từ thân


dứa cho thấy enzyme này có thể được tủa bằng acetone, tinh sạch bằng sắc ký trao đổi


ion trên cột trao đổi cation UNO-S và đông khô bằng máy Lyopro 6000. Từ 97 gam


thân dứa nhận được 50 ml dịch, sau khi tủa bằng acetone thu được 9 ml dịch tủa, sau


khi qua cột sắc ký nhận được 108 ml dịch enzyme tinh khiết với nồng độ là 0,53


mg/ml (chiếm 11,7 % protein tổng số), hiệu suất thu hồi hoạt tính 65,65 %. Và cuối


cùng đông khô sản phẩm nhận được 4,6 gam bột bromelain với hàm lượng và hoạt


o

tính enzyme nguyên vẹn sau 4 tuần nếu giữ ở -20 C. Kiểm tra qua SDS-PAGE cho


thấy sản phẩm bromelain có độ tinh sạch cao.


MỤC LỤC


Nội dung Trang


LỜI CẢM ƠN . iii


TÓM TẮT . iv


SUMMARY v


MỤC LỤC vi


DANH SÁCH CÁC BẢNG .x


DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ . xi


PHẦN 1. MỞ ĐẦU .1


1.1. Đặt vấn đề . 1


1.2. Mục tiêu của đề tài .2


1.3. Mục đích .2


1.4. Giới hạn của đề tài 2


1.5. Nội dung thực hiện .2


PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3


2.1. Giới thiệu sơ lược về cây dứa .3


2.2. Giới thiệu về enzyme 5


2.2.1. Sơ lược về enzyme 5


2.2.1.1. Định nghĩa về enzyme 5


2.2.1.2. Phân loại enzyme .5


2.2.1.3. Sự khác nhau về chất lượng enzyme và thị trường enzyme công nghiệp 7


2.2.2. Các yếu tố ảnh huởng đến vận tốc phản ứng enzyme. 8


2.2.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme 8


2.2.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất .8


2.2.2.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ .8


2.2.2.4. Ảnh hưởng của pH .9


2.3. Enzyme Protease 9


2.3.1. Giới thiệu sơ lược các enzyme protease 10


2.3.1.1. Protease vi sinh vật . 10


2.3.1.2. Protease động vật . 10


2.3.1.3. Protease thực vật 10


2.3.2. Ứng dụng của enzyme protease . 10


2.4. Enzyme bromelain thu nhận từ dứa 11


2.4.1. Giới thiệu Enzyme bromelain 11


2.4.2. Tính chất vật lí . 11


2.4.3. Tính chất hóa học 12


2.4.3.1. Cấu tạo hóa học 12


2.4.3.2. Cấu trúc không gian . 13


2.4.4. Hoạt tính của bromelain 13


2.4.4.1. Cơ chế tác động 14


2.4.4.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính . 14


2.4.4.3. Các chất bảo vệ enzyme . 16


2.4.5. Ứng dụng của bromelain . 17


2.4.6. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về enzyme Protease (chủ yếu là enzyme

bromelain) . 17


2.4.6.1. Nghiên cứu trong nước . 17


2.4.6.2. Nghiên cứu ngoài nước 18


2.5. Các kỹ thuật cơ bản trong quá trình tinh sạch protein/enzyme 19


2.5.1. Chuẩn bị dịch protein thô 19


2.5.2. Ổn định protein trong dịch chiết thô. 19


2.5.3. Các phương pháp tủa protein .20


2.5.3.1. Tủa bằng muối Sulfate ở các nồng độ khác nhau. .20


2.5.3.2. Tủa bằng dung môi hữu cơ .20


2.5.3.3. Tủa bằng điểm đẳng điện .21


2.5.3.4. Tủa bằng các loại polymer .21


2.5.3.5. Tủa bằng chất đa điện phân 21


2.6. Tinh sạch protein 21


2.6.1. Tại sao cần tinh sạch enzyme? 21


2.6.2. Mục tiêu và chiến lược tinh sạch enzyme .22


2.6.2.1. Mục tiêu .22


2.6.2.2. Chiến lược tinh sạch enzyme .22


2.6.3. Giới thiệu các phương pháp phân tách cơ bản trong tinh sạch enzyme 23


2.6.4. Sự lựa chọn phương pháp tinh sạch protein 23


2.7. Giới thiệu phương pháp sắc ký sinh Học .24


2.7.1. Các kỹ thuật sắc ký sinh học cơ bản 25


2.7.2. Sắc ký trao đổi ion .25


2.7.2.1. Khái niệm .25


2.7.2.2. Chọn chất trao đổi ion 27


2.7.2.3. Chọn dung dịch đệm 29


2.7.2.4. Phương pháp rửa thôi protein .29


2.8. Phương pháp đông khô sản phẩm (Freeze-drying) 30


2.8.1. Khái niệm 30


2.8.2. Các giai đoạn của quá trình đông khô .30


2.8.3. Máy đông khô được sử dụng trong nghiên cứu .32


2.8.4. Ứng dụng của phương pháp đông khô 32


2.9. Phương pháp điện di trên Gel SDS-PAGE (Hames, 1998) 32


2.9.1. Giới thiệu .32


2.9.2. Cấu tạo của gel Polyacrylamide 33


2.9.3. Nguyên tắc hoạt động của SDS-PAGE .34


PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .35


3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành .35


3.1.1. Thời gian .35


3.1.2. Địa điểm 35


3.2. Vật liệu .35


3.2.1. Thân dứa 35


3.2.2. Hóa chất .35


3.2.3. Dụng cụ và thiết bị. .35


3.3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu .36


3.3.1. Nội dung 36


3.3.1.1. Cách lấy mẫu 36


3.3.1.2. Các bước chính để thu nhận enzyme bromelain từ dứa .36


3.3.1.3. Xác định hoạt tính và protein tổng số 36


3.3.1.4. Điện di SDS-PAGE xác định trọng lượng phân tử và độ tinh sạch của enzyme. 36


3.3.2. Phương pháp thí nghiệm 37


3.3.2.1. Thí nghiệm ly trích và khảo sát các tác nhân kết tủa .37


a. Thí nghiệm ly trích enzyme bromelain từ thân dứa ở quy mô nhỏ 37


b. Thí nghiệm khảo sát các tác nhân kết tủa 37


3.3.2.2. Thí nghiệm xác định hàm lượng và hoạt tính enzyme .38


a. Định lượng protein theo phương pháp Bradford (1976) 38


b. Xác định hoạt tính protease theo phương pháp Anson 39


3.3.2.3. Thí nghiệm tinh sạch enzyme bromelain bằng sắc ký trao đổi ion 42


a. Nguyên tắc .42


b. Các bước tiến hành thí nghiệm 42


3.3.2.4. Thí nghiệm điện di enzyme bromelain sau tinh sạch .44


PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .47


4.1. Khảo sát các tác nhân tủa .47


4.1.1. Kết quả xây đường chuẩn albumin theo phương pháp Bradford 47


4.1.2. Kết quả xây dựng đường chuẩn tyrosine theo phương pháp Anson .48


4.1.3. Kết quả xác định hàm lượng protein và hoạt tính enzyme của dịch thô .48


4.1.4. Kết quả xác định hàm lượng protein và hoạt tính enzyme của dịch tủa 49


4.1.4.1. Tủa với tác nhân amonium sulfate .49


4.1.4.2. Tủa với tác nhân acetone 50


4.1.4.3. Hiệu suất thu nhận enzyme bromelain thân bằng tác nhân tủa amonium sulfate và

o

acetone ở 4 C .51


4.2. Kết quả tinh sạch enzyme bromelain bằng hệ thống tinh sạch BioLogic DuoFlow. .54


4.2.1. Kết quả thiết lập qui trình các bước cho máy BioLogic DuoFlow thực hiện 54


4.2.2. Kết quả của quá trình tinh sạch .60


a. Hàm lượng protein và hoạt tính bromelain trước tinh sạch .60


b. Hàm lượng protein và hoạt tính bromelain sau tinh sạch 61


c. Hiệu suất tinh sạch qua các giai đoạn 61


4.3. Đông khô sản phẩm 62


4.3.1. Kết quả đo hàm lượng protein enzyme sau đông khô 2 tuần; 4 tuần. .63


4.3.2. Kết quả hoạt tính enzyme sau đông khô 2 tuần; 4 tuần .63


4.4. Kết quả điện di xác định trọng lượng phân tử và độ tinh sạch .64


PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .68


5.1. Kết luận 68


5.2. Đề nghị .69


PHẦN 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO .70