Chuyên Đề Tinh chế protein tái tổ hợp gnrh-tbk ở e. Coli

TINH CHẾ PROTEIN TÁI TỔ HỢP GNRH-TBK Ở E. COLI


Đặng Thành Nam & Phan Văn Chi

Viện Công nghệ Sinh học, Trung tâm KHTN & CNQG


1. ĐẶT VẤN ĐỀ


GnRH-TBK là một “độc tố miễn dịch” tái tổ hợp (Recombinant Immunotoxin-IT) được tạo ra nhờ sự kết hợp giữa thành phần hướng đích là hormon giải phóng kích dục tố (Gonadotropin Reseasing Hormon-GnRH) và thành phần độc tố là một protein bất hoạt ribosom lớp 1 Trichobakin[1, 2], nhằm tiêu diệt một cách chọn lọc các dòng tế bào bộc lộ GnRH receptor bề mặt đặc hiệu.


TBK được tách chiết từ cây Trichosanthes sp. Bac Kan, có hoạt tính N-glycosidase, có khả năng nhận biết và phân cắt đặc hiệu gốc adenin ở vị trí 4324 của ARN ribosom 28S dẫn đến ức chế quá trình tổng hợp protein và gây chết tế bào [3, 4]. GnRH là một neurodecapeptid, có ái lực cao (Kd khoảng 10-9 M) với các GnRH receptor (GnRHR) và không gây đáp ứng miễn dịch. GnRHR đã được phát hiện thấy nhiều trên bề mặt tế bào thuộc các mô ung thư vú, tử cung, tuyến tiền liệt, tuyến tuỵ[5-9]. Hơn nữa GnRH cũng đã được sử dụng làm thành phần hướng đích trong một số độc tố miễn dịch tái tổ hợp như recombinant GnRH-PAP fusion toxin. Trong đó PAP là cũng là một protein bất hoạt ribosom được tách chiết từ cây Phytolacca americana. GnRH-PAP đã có khả năng ức chế đặc hiệu một số dòng tế bào ung thư có biểu hiện các GnRHR bề mặt[5].


Tiếp nối những nghiên cứu về thiết kế vector biểu hiện gen mã hoá cho protein lai GnRH-TBK ở E.coli [1], trong bài này chúng tôi giới thiệu về các điều kiện biểu hiện và kết quả tinh chế loại protein tái tổ hợp này.


2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU


2.1 Nguyên liệu


Vector biểu hiện pGnRH-TBK mang gen mã hoá cho protein lai GnRH-TBK được thiết kế tại Phòng Hoá sinh Protein, Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội [1]. Để nghiên cứu biểu hiện có sử dụng tế bào E. coli chủng BL21(DE3), môi trường Luria-Bertani(LB), isopropylthio-b-D-galactoside(IPTG), ampicillin và các hoá chất thông thường khác.


2.2 Phương pháp nghiên cứu


2.2.1 Điện di SDS-PAGE


Điện di biến tính protein bằng SDS-PAGE (12,5%) được tiến hành theo các phương pháp của Laemmli [12].


2.2.2 Sắc kí trao đổi ion trên hệ FPLC


Sau khi biểu hiện, sinh khối tế bào được thu lại và phá bằng siêu âm trong đệm 50 mM Tris-HCL pH 7,0 có chứa 20 mM EDTA, Triton X-100 0,1%, lysozyme 100mg/ml. Huyền dich tế bào sau khi phá được ly tâm ở 12 000 vòng/phút trong 20 phút, để tách riêng phần cặn và nổi. Phần nổi được nạp thẳng vào cột CM- Sepharose(XK- 16/20). Protein mang điện tích trái dấu sẽ được giữ trên cột, còn các protein khác bị rửa trôi khỏi cột bằng đệm Tris-HCL pH 7,0. Cột được tiếp tục rửa cho đến khi A280 nm trở lại đường nền. Mẫu được thôi ra khỏi cột bằng gradien nồng độ 0,0-0,4 M NaCl nhờ chương trình phần mềm trên hệ FPLC (Pharmacia-Biotech).


2.2.3 Western blotting và phân tích trình tự đầu N của protein tái tổ hợp


Các phương pháp Western blotting và xác định trình tự các axit amin đầu N theo nguyên lý Edman được tiến hành như đã mô tả [13]