Thạc Sĩ Tìm hiểu sự tạo mô sẹo và phát sinh hình thái cây mướp đắng(momordica charantia l.)trong nuôi cấy in

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn tất luận văn này, em xin chân thành cảm ơn
Thầy TS. Nguyễn Du Sanh, người thầy đã dìu dắt em từ những buổi đầu khi
em mới tốt nghiệp đại học, đã tận tình hướng dẫn, động viên trong lúc khó khăn,
truyền đạt những kiến thức, những kinh nghiệm quí báu trong quá trình làm đề tài và
học tập cũng như trong cuộc sống. Suốt thời gian qua, thầy đã giảng dạy cho em rất
nhiều kiến thức, em ngày càng hiểu thêm và có niềm tin vào bản thân mình hơn
trong quá trình lên lớp.
Thầy TS. Lê Thương, Cô TS. Võ Thị Phương Khanh, Cô Ths. Nguyễn Thị Thu,
Thầy PGS.TS. Nguyễn Anh Dũng, các thầy cô trong Bộ môn SHCS, SHTN, SHTV đã
giảng dạy, tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho em trong học tập và công
tác.
Thầy TS. Phan Văn Tân, đã giảng dạy, bồi dưỡng những kiến thức sinh lý
thực vật, giúp em tập làm quen với nghiên cứu khoa học và truyền đạt kinh nghiệm
sống thật bổ ích.
Các thầy, cô trong Hội đồng đã đọc, nhận xét và đưa ra những ý kiến quí báu
về luận văn.
Thầy PGS. TS. Bùi Trang Việt, đã tạo điều kiện thuận lợi trong thời gian em
học tập và làm luận văn tại trường Đại học KHTNTPHCM.
Thầy Hoang, cô Hương, cô Tú, cô Xuân, thầy Kiệt, chị Hiền, anh Kiệt, Chị
Hương và các bạn lớp cao học K18, trường Đại học KHTNTPHCM đã giúp đỡ trong
suốt thời gian làm luận văn.
Chị Tuyến, anh Sỹ, chị Thanh, Bốn, Định, Vũ Duyên, anh Huệ, Duyên và các
anh chị lớp cao học SHTN K2 đã động viên, giúp đỡ trong quá trình học tập và làm
đề tài tốt nghiệp.
Các thầy cô ở phòng Đào tạo sau Đại học đã tạo điều kiện thuận lợi trong iii
Cuối cùng, con xin chân thành cảm ơn đến ba Tường, mẹ Tham, mẹ Đông đã
luôn yêu thương, chăm sóc con. Cảm ơn gia đình chị Lan, gia đình chị Hằng. Cảm
ơn anh Thảo, người bạn đời luôn ở bên chia sẻ, động viên, giúp đỡ em. Cảm ơn con,
Anh Tuấn là niềm tin, thương yêu cho mẹ phấn đấu.
Trần Thị Phương Hạnh iv
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
2,4-D : 2,4-dichlorophenoxyacetic acid
AIA : Indol-3acetic acid
BA : Benzyladenine
CĐHH : Cường độ hô hấp
ĐTD : Đốt tử diệp (đốt thân mang tử diệp)
TD : Tử diệp
HD : Trụ hạ diệp
MS : Murashige và Skoog (1962)
GTTLT : Gia tăng trọng lượng tươi
GTTLK : Gia tăng trọng lượng khô v
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết . 1
2. Mục tiêu của đề tài 1
3. Ý nghĩa khoa học . 2
4. Ý nghĩa thực tiễn . 2
Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1Giới thiệu chung về cây mướp đắng 3
1.1.1 Vị trí phân loại 3
1.1.2 Đặc tính sinh học . 3
1.1.2.1 Mô tả hình thái . 3
1.1.2.2 Điều kiện sống và phân bố 3
1.1.2.3 Sâu bệnh . 4
1.1.3 Thành phần và tác dụng các hợp chất tự nhiên của cây mướp đắng . 4
1.2. Sự tạo mô sẹo và phát sinh hình thái 6
1.2.1 Sự tạo mô sẹo . 6
1.2.2 Sự phát sinh hình thái 7
1.2.3 Vai trò của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật . 9
1.2.3.1 Auxin 9
1.2.3.2 Cytokinin 10
1.2.3.3 Sự phối hợp auxin và cytokinin trong phát sinh cơ quan 11
1.2.2.4. Giberelin 12
1.2.2.5. Acid abcisic (ABA) . 12
1.2.2.6. Ethylen 12
1.2.3 Một số yếu tố khác ảnh hưởng đến sự phát sinh hình thái thực vật 13
1.2.3.1 Tuổi của mô cấy . 13 vi
1.2.3.2. Ánh sáng 13
1.2.3.3. Nhiệt độ . 13
1.3 Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nước . 13
1.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 13
1.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước . 15
Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊM CỨU
2.1 Nội dung nghiên cứu 16
2.2 Vật liệu nghiên cứu 16
2.3 Phương pháp nghiên cứu 18
2.3.1 Thí nghiệm khử trùng mẫu cấy 18
2.3.2 Thí nghiệm tạo mô sẹo từ các nguồn mẫu của cây mướp đắng 18
2.3.3 Thí nghiệm tạo chồi từ mô sẹo và tạo rễ từ những chồi thu nhận 24
2.3.4 Thí nghiệm khả năng thích ứng của cây con ngoài vườn ươm 26
2.3.5 Đo cường độ hô hấp . 26
2.3.6 Xử lý số liệu . 26
Chương 3 KẾT QUẢ
3.1 Ảnh hưởng của nồng độ các chất khử trùng và thời gian khử trùng lên
mẫu hột mướp đắng . 27
3.2 Sự tạo mô sẹo . 28
3. 2.1 Sự hình thành và tăng trưởng mô sẹo từ các nguồn mẫu 28
3.2.1.1 Sự hình thành và tăng trưởng của mô sẹo từ lá 28
3.2.1.2 Sự hình thành và tăng trưởng của mô sẹo từ lớp mỏng đốt tử diệp 31
3.2.1.3 Sự hình thành và tăng trưởng của mô sẹo từ lớp mỏng tử diệp . 34
3.2.1.4 Sự hình thành và tăng trưởng của mô sẹo từ lớp mỏng trụ hạ diệp . 37
3.2.2 Sự thay đổi hình thái trong quá trình tạo mô sẹo 41
3.2.3 Sự thay đổi cường độ hô hấp (CĐHH) theo thời gian của mô sẹo được hình
thành từ các nguồn mẫu . 41 vii
3.2.3.1 Sự thay đổi cường độ hô hấp (CĐHH) theo thời gian của mô sẹo được hình
thành từ lá . 42
3.2.3.1 Sự thay đổi cường độ hô hấp (CĐHH) theo thời gian của mô sẹo được hình
thành từ lớp mỏng đốt tử diệp 43
3.2.3.1 Sự thay đổi cường độ hô hấp (CĐHH) theo thời gian của mô sẹo được hình
thành từ lớp mỏng tử diệp 44
3.2.3.1 Sự thay đổi cường độ hô hấp (CĐHH) theo thời gian của mô sẹo được hình
thành từ lớp mỏng trụ hạ diệp 45
3.2.3 Sự gia tăng trọng lượng tươi và trọng lượng khô của mô sẹo được hình thành từ
các nguồn mẫu 47
3.3 Sự phát sinh chồi 48
3.3.1 Sự hình thành và tăng trưởng của cụm chồi từ mô sẹo . 48
3.3.2 Sự thay đổi hình thái trong quá trình phát sinh chồi . 52
3.4 Sự phát sinh rễ 54
3.4.1 Sự hình thành và tăng trưởng rễ . 54
3.2.2 Sự thay đổi hình thái trong quá trình phát sinh rễ . 56
3.5 Sự thích ứng của cây con in vitro ngoài vườn ươm 57
Chương 4 BIỆN LUẬN
4.1 Sự hình thành mô sẹo 58
4.1.1 Sự thay đổi hình thái trong quá trình tạo sẹo . 58
4.2 Các biến đổi sinh lý trong quá trình hình thành mô sẹo 58
4.2 Sự phát sinh chồi từ mô sẹo của cây mướp đắng . 59
4.2.1 Sự thay đổi hình thái trong sự phát sinh chồi 59
4.3.3 Các biến đổi sinh lý trong quá trình phát sinh chồi 60
4.3 Sự phát sinh rễ từ chồi mướp đắng 61
4.3.1 Ảnh hưởng của AIA trong sự phát sinh rễ 61
4.3.2 Sự thay đổi hình thái trong quá trình phát sinh rễ . 61 viii
4.3.3 Các biến đổi sinh lý trong quá trình phát sinh rễ 62
4.4 Sự thích ứng của cây con in vitro ngoài vườn ươm . 62
KẾT LUẬN & KIẾN NGHỊ 63
TÀI LIỆU THAM KHẢO 64ix
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1a Bố trí thí nghiệm . 19
Bảng 2.1b Bố trí thí nghiệm . 19
Bảng 2.2a Bố trí thí nghiệm . 20
Bảng 2.2b Bố trí thí nghiệm . 20
Bảng 2.3a Bố trí thí nghiệm . 21
Bảng 2.3b Bố trí thí nghiệm . 21
Bảng 2.4a Bố trí thí nghiệm . 22
Bảng 2.4b Bố trí thí nghiệm . 22
Bảng 2.4c Bố trí thí nghiệm . 23
Bảng 2.4d Bố trí thí nghiệm . 23
Bảng 2.6a Bố trí thí nghiệm . 24
Bảng 2.6b Bố trí thí nghiệm . 25
Bảng 2.7 Bố trí thí nghiệm . 25
Bảng 3.1a Sự thay đổi trọng lượng tươi của mô sẹo có nguồn gốc từ lá sau 2, 3, 4,
và 5 tuần nuôi cấy trên môi trường chỉ bổ sung auxin (2,4-D). . 28
Bảng 3.1b Sự thay đổi trọng lượng tươi của mô sẹo có nguồn gốc từ lá sau 2, 3, 4,
và 5 tuần nuôi cấy trên môi trường có bổ sung auxin (2,4-D hay AIA) và
cytokinin (BA) .29
Bảng 3.2a Sự thay đổi trọng lượng tươi của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng
đốt tử diệp sau 2, 3, 4, và 5 tuần nuôi cấy trên môi trường chỉ bổ sung auxin (2,4-
D) . 31
Bảng 3.2b Sự thay đổi trọng lượng tươi của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng ĐTD
sau 2, 3, 4, và 5 tuần nuôi cấy trên môi trường có bổ sung auxin (2,4-D hay AIA) và
cytokinin (BA). 32 x
Bảng 3.3a Sự thay đổi trọng lượng tươi của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng tử
diệp cắt dọc sau 2, 3, 4, và 5 tuần nuôi cấy trên môi trường chỉ bổ sung auxin
(2,4-D) . 34
Bảng 3.3b Sự thay đổi trọng lượng tươi của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng tử diệp
sau 2, 3, 4, và 5 tuần nuôi cấy trên môi trường có bổ sung auxin (2,4-D hay AIA) và
cytokinin (BA). 35
Bảng 3.4a Sự thay đổi trọng lượng tươi của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng trụ hạ
diêp cắt dọc sau 2, 3, 4, và 5 tuần nuôi cấy trên môi trường chỉ bổ sung auxin 2,4-D . 37
Bảng 3.4b Sự thay đổi trọng lượng tươi của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng trụ hạ
diệp cắt dọc sau 2, 3, 4, và 5 tuần nuôi cấy trên môi trường có bổ sung auxin (2,4-D
hay AIA) và cytokinin (BA). . 38
Bảng 3.4c Sự thay đổi trọng lượng tươi của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng trụ
hạ diệp cắt ngang sau 2, 3, 4, và 5 tuần nuôi cấy trên môi trường chỉ bổ sung
auxin (2,4-D) 38
Bảng 3.4d Sự thay đổi trọng lượng tươi của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng trụ hạ
diệp cắt ngang và cắt ngang sau 2, 3, 4, và 5 tuần nuôi cấy trên môi trường có và
không bổ sung auxin (2,4-D hay AIA) và cytokinin (BA). 39
Bảng 3.5a: Ảnh hưởng của BA lên sự hình thành chồi từ mô sẹo sau 4 tuần nuôi
cấy. . 48
Bảng 3.5b Ảnh hưởng của BA và AIA lên sự hình thành và tăng trưởng chồi từ mô
sẹo sau 4 tuần nuôi cấy . 49
Bảng 3.6 Ảnh hưởng của AIA lên sự hình thành và tăng trưởng rễ từ chồi sau 4 tuần
nuôi cấy. . 54
Bảng 3.7 Khả năng thích ứng của cây con in vitro ngoài vườn ươm 57 xi
DANH MỤC HÌNH
Hình 3.1 Tỷ lệ mẫu sạch và sống sau khi khử trùng bởi dung dịch chất khử trùng
với nồng độ và thời gian khác nhau . 27
Hình 3.2 Sự thay đổi CĐHH của mô sẹo có nguồn gốc từ lá theo thời gian. 42
Hình 3.3 Sự thay đổi CĐHH của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng đốt tử diệp theo
thời gian. 43
Hình 3.4 Sự thay đổi CĐHH của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng tử diệp theo thời
gian. 44
Hình 3.5 Sự thay đổi CĐHH của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng trụ hạ diệp cắt
dọc theo thời gian . 45
Hình 3.6 Sự thay đổi CĐHH của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng trụ hạ diệp cắt
ngang theo thời gian. 46
Hình 3.7 Sự gia tăng trọng lượng tươi và gia tăng trọng lượng khô giữa các nghiệm
thức cho mô sẹo tốt nhất ở các nguồn mẫu 47
Hình 3.8 Sự hình thành và tăng trưởng rễ sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có
và không bổ sung AIA. 54 xii
DANH MỤC ẢNH
Ảnh 1.1: Cây mướp đắng . 3
Ảnh 2.1: Cây khổ qua 10 ngày tuổi (A), lá (B), tử diệp (C), đốt tử diệp (D), trụ hạ
diệp cắt dọc (1mm) (E), trụ hạ diệp cắt ngang (1mm) (F). 17
Ảnh 3.1 Mô sẹo từ lá 3 tuần tuổi, mũi tên trắng chỉ rễ. . 30
Ảnh 3.2 Mô sẹo từ lá 5 tuần tuổi. 31
Ảnh 3.3 Mô sẹo từ lớp mỏng đốt tử diệp 3 tuần tuổi, mũi tên trắng chỉ rễ 33
Ảnh 3.4 Mô sẹo từ lớp mỏng đốt tử diệp 5 tuần tuổi. . 34
Ảnh 3.5Mô sẹo từ lớp mỏng tử diệp 3 tuần tuổi, mũi tên trắng chỉ rễ. . 36
Ảnh 3.6 Mô sẹo từ lá lớp mỏng tử diệp 5 tuần tuổi. 37
Ảnh 3.7Mô sẹo từ lớp mỏng trụ hạ diệp cắt dọc và ngang 3 tuần tuổi, mũi tên trắng
chỉ rễ. 40
Ảnh 3.8Mô sẹo từ lớp mỏng trụ hạ diệp cắt dọc và ngang 5 tuần tuổi . 40
Ảnh 3.9 Sự phân chia của tế bào ở gân lá (A), các tế bào mô sẹo phía ngoài sau 2
tuần (B), các tế bào mô sẹo phía ngoài sau 5 tuần (C) . 41
Ảnh 3.10 Chồi được hình thành và phát triển từ mô sẹo sau 1 tuần nuôi cấy, mũi tên
xanh chỉ nốt tròn, mũi tên trắng chỉ chồi . 50
Ảnh 3.11 Chồi được hình thành và phát triển từ mô sẹo sau 2 tuần nuôi cấy 51
Ảnh 3.12 Chồi được hình thành và phát triển từ mô sẹo sau 4 tuần nuôi cấy. 52
Ảnh 3.13 Phẫu thức cắt ngang mô sẹo qua các nốt xanh (A), chồi được hình thành từ
các nốt trên mô sẹo sau 10 ngày nuôi cấy (B), 15 ngày (C), mũi tên xanh chỉ nối
xanh, ,mũi tên đỏ chỉ bó mạch, mũi tên vàng chỉ phát thể lá, mũi tên trẵn chỉ đỉnh
sinh trưởng.
53
Ảnh 3.14 Rễ được hình thành sau 4 tuần tuổi nuôi cấy . 55 xiii
Ảnh 3.15 Phẫu thức cắt ngang gốc thân cây mướp đắng in vitro 0 ngày (A), 5 ngày
(B), sơ khởi rễ kéo dài (C), rễ (D), nuôi cấy trên môi trường bổ AIA 0,5 mg/l, mũi
tên trắng chỉ tượng tầng libe-mộc, mũi tên mũi xanh chỉ tế bào phân chia, tên mũi đỏ
chỉ sơ khởi rễ, mũi tên tên vàng chỉ rễ kéo dài 56
Ảnh 3.16 Cây mướp đắng ngoài vườn ươm 57 1
1. Tính cấp thiết
Mướp đắng hay còn được gọi là khổ qua, lương qua (Momordica charantia
L.), thuộc họ Bầu bí (Cucurbitaceae) có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới châu Phi và
miền nam châu Á, hiện nay được trồng rộng rãi ở khắp các nơi trong vùng nhiệt
đới và cận nhiệt đới [28].
Nước ta có khí hậu thổ nhưỡng rất phù hợp với cây mướp đắng và cho năng
suất cao. Mướp đắng ngoài việc sử dụng làm nguồn thực phẩm còn cung cấp dược
liệu cho các nhà bào chế thuốc [26].
Cho đến nay, đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về mặt dược liệu của
cây mướp đắng (Momordica charantia L.), chủ yếu tập trung vào việc ly trích,
phân tích các thành phần hoá học của các hợp chất thứ cấp có trong cây [1],[9].
Trong khi những nghiên cứu về sinh lý cơ bản còn rất ít. Ngoài ra, việc nhân
giống cây chủ yếu bằng phương pháp gieo hạt, cây con rất dễ bị bệnh tấn công làm
cho năng suất, hàm lượng và chất lượng các hợp chất tự nhiên trong cây giảm sút.
Vì vậy, việc nhân giống cây dược liệu đang được các nhà nuôi cấy mô quan tâm.
Nuôi cấy mô tế bào thực vật đã không ngừng phát triển và đem lại hiệu quả thiết
thực trong công tác chọn tạo và nhân giống cây trồng. Do đó, để có giống cây
mướp đắng đồng nhất, sạch bệnh và số lượng lớn, nuôi cấy mô cây mướp đắng
đang trở thành việc làm cần thiết.
Đề tài: “Tìm hiểu sự tạo mô sẹo và phát sinh hình thái cây mướp đắng
(Momordica charantia L.) trong nuôi cấy in vitro” được thực hiện nhằm hiểu
biết thêm về khoa học nuôi cấy mô, vi nhân giống trên đối tượng mướp đắng. Đây
cũng là nghiên cứu cơ bản để ứng dụng cho các đối tượng khác thuộc họ bầu bí.
2. Mục tiêu của đề tài
- Tìm được môi trường thích hợp nhất cho sự hình thành mô sẹo và phát
sinh hình thái của mướp đắng trong nuôi cấy in vitro. 2
- Xác định khả năng hình thành mô sẹo trên những nguồn mẫu khác nhau
(tử diệp, trụ hạ diệp, lá non, ) và ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng lên sự
phát sinh hình thái trong nuôi cấy in vitro.
3. Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên cứu sự tạo mô sẹo và phát sinh hình thái cây mướp đắng
trong nuôi cấy in vitro sẽ tìm ra mối liên hệ giữa mô, tế bào, các giai đoạn phát
sinh hình thái và giải thích vai trò của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong
sự phát sinh cơ quan ở cây mướp đắng.
4. Ý nghĩa thực tiễn
Tìm hiểu sự tạo mô sẹo và phát sinh hình thái cây mướp đắng trong nuôi
cấy in vitro để biết được phương pháp, kỹ năng nuôi cấy mô trên đối tượng mướp
đắng, góp phần xây dựng thành một qui trình vi nhân giống, nghiên cứu những sản
phẩm nuôi cấy in vitro, Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆUChương 4
BÀN LUẬNChương 3
KẾT QUẢChương 2
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨUKẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ