Luận Văn Thu thập dịch tiết từ fasciola gigantica và sử dụng làm kháng nguyên trong chẩn đoán

Bệnh sán lá gán lớn ở trâu bò và các động vật nhai lại khác như dê, cừu là một trong những nguyên nhân gây tổn thất kinh tế trong ngành công nghiệp chăn nuôi. Ngoài ra, bệnh còn gặp ở người với những triệu chứng lâm sàng không rõ ràng nên gây khó khăn trong việc chẩn đoán và điều trị bệnh. Trước những yêu cầu cấp thiết như vậy, được sự đồng ý của Viện Pasteur TPHCM và trường đại học Nông Lâm TPHCM, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Thu thập dịch tiết từ Fasciola gigantica và sử dụng làm kháng nguyên trong chẩn đoán”
Các kết quả thu được:


Số lượng sán thu thập cho nghiên cứu là 17 con và 80 ml dịch tiết.
Xác định được nồng độ protein trong dịch tiết của sán lá gan lớn bằng phương pháp Bradford.
Xác định được thành phần protein trong dịch tiết bằng phương pháp điện di SDS-PAGE 12%.
Dùng phương pháp Ouchterlony, sử dụng protein tiết từ sán làm kháng nguyên, phát hiện kháng thể ở huyết thanh bệnh nhân.
Tạo giá sắc ký ái lực Sepharose 4B – protein(s) tiết để tinh chế kháng thể đặc hiệu ở huyết thanh người nhiễm sán Fasciola sp.
Tinh chế kháng thể kháng Fasciola sp từ huyết thanh bệnh nhân nhiễm sán lá gan lớn.
Sử dụng kháng thể tinh chế qua sắc ký ái lực miễn dịch để chế tạo hệ thống thử nghiệm phát hiện kháng nguyên.

MỤC LỤC

CHƯƠNG TRANG
Trang tựa
Lời cảm ơn . iii
Tóm tắt iv
Mục lục . v
Danh sách các chữ viết tắt . vii
Danh sách các bảng viii
Danh sách các hình . ix
PHẦN 1: MỞ ĐẦU

1.1Đặt vấn đề . 1

1.2Mục đích của đề tài 2

1.3 Yêu cầu . 2
PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược lịch sử nghiên cứu sán lá gan và bệnh do sán lá gan lớn gây nên 3
2.2 Vòng đời của sán lá gan lớn (Fasciola sp) 3
2.3 Hình thái sinh học của sán lá gan lớn (Fasciola sp) . 5

2.4 Tác hại của bệnh do sán lá lớn ở gan 6
2.4.1 Ở gia súc . 6
2.4.2 Ở người . 7
2.5. Chẩn đoán, phòng ngừa và điều trị bệnh sán lá gan lớn 8
2.5.1 Ở gia súc . 8
2.5.2 Ở người . 9
2.6 Dịch tiết từ sán lá gan lớn trong thời gian ký sinh có vai trò sinh học 11
2.6.1 Protein tiết và đáp ứng miễn dịch . 11
2.6.2 Hoạt động protease . 12
PHẦN 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.
3.1 Thời gian và địa điểm . 13
3.2 Vật liệu 13
3.2.1 Đối tượng nghiên cứu . 13
3.2.2 Thiết bị và dụng cụ . 13
3.2.2.1 Thiết bị . 13
3.2.2.2. Dụng cụ 14
3.2.3 Hóa chất và cách chuẩn bị các dung dịch . 14
3.3 Phương pháp 17
3.3.1 Quy trình lấy mẫu 17
3.3.2 Định lượng protein bằng phương pháp đo mật độ quang OD280 17
3.3.3 Xác định nồng độ protein bằng phương pháp Bradford 18
3.3.4 Điện di SDS-PAGE 12% xác định thành phần protein trong dịch tiết của sán lá gan lớn Fasciola gigantica .21
3.3.5 Phương pháp miễn dịch khuếch tán kép Ouchterlony 26
3.3.6 Quy trình tạo cột sắc ký ái lực miễn dịch để tinh chế kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên tiết của sán lá gan lớn 27

Kỹ thuật ELISA phát hiện kháng nguyên tiết trong huyết thanh hoặc trong phân bệnh nhân 28

PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Nồng độ protein trong dịch tiết của sán lá gan lớn được xác định bằng phương pháp Bradford 31
4.2 Kết quả điện di SDS-PAGE 12% xác định thành phần protein trong dịch tiết của sán lá gan lớn 31
4.3 Kết quả khuếch tán miễn dịch Ouchterlony kiểm tra độ đặc hiệu của kháng nguyên tiết trong vật liệu tiết của sán lá gan lớn so với kháng nguyên thân của chính nó 33
4.4 Kết quả tinh chế kháng thể kháng Fasciola sp từ huyết thanh bệnh nhân 33
4.5 Giải hấp kháng thể từ cột sắc ký ái lực tạo với kháng nguyên tiết 35
4.6 Kết quả phát hiện kháng nguyên tiết trong huyết thanh bệnh nhân bằng phương pháp ELISA 35
PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 37
PHẦN 6: TÀI LIỆU THAM KHẢO . 38
PHỤ LỤC . 41