Thạc Sĩ Thu nhận và xử lý ngà răng người làm giá thể nuôi cấy tế bào gốc tủy răng người

THẠC SĨ SINH HỌC
NĂM 2012

Mục lục i
Danh mục từ viết tắt . iv
Danh mục bảng và đồ thị vi
Danh mục hình . vii

ĐẶT VẤN ĐỀ . 1
Chương 1. TỒNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Kỹ nghệ mô . 3
1.1.1. Giá thể ba chiều . 3
1.1.1.1. Các đặc tính của giá thể ba chiều 4
1.1.1.2. Nguyên liệu thiết kế giá thể 4
1.1.2. Tế bào trong kỹ nghệ mô . 4
1.1.3. Khả năng tương tác của tế bào với giá thể . 5
1.1.3.1. Sự bám dính . 5
1.1.3.2. Sự di chuyển 5
1.1.3.3. Sự tăng trưởng và biệt hóa 6
1.1.4. Giá thể dùng trong nha khoa . . 8
1.2. Ngà răng 11
1.2.1. Cấu trúc ngà răng . 12
1.2.2. Thành phần cấu tạo và các đặc tính của ngà răng 13
1.2.2.1. Thành phần hữu cơ . 13
1.2.2.2. Thành phần vô cơ . 14
1.2.2.3. Đặc tính của ngà răng . 14
1.2.3. Giá thể ngà răng . 15
1.3. Tế bào gốc trong mô tủy răng 15
1.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước . 16
1.4.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước . 16
1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước 18

Chương 2. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu . 19
2.1.1. Mẫu vật . 19
2.1.2. Dụng cụ và thiết bị 20
2.1.3. Hóa chất 21
2.2. Phương pháp . 24
2.2.1. Sơ đồ quy trình thí nghiệm tổng quát 24
2.2.2. Tạo giá thể từ ngà răng người 25
2.2.3. Qui trình nuôi cấy tế bào tủy răng người . 26
2.2.3.1. Nuôi cấy sơ cấp 26
2.2.3.2. Phương pháp cấy chuyền tế bào tủy răng 27
2.2.4. Đánh giá tế bào tủy răng thu được 28
2.2.4.1. Phương pháp xác định kiểu hình miễn dịch . 28
2.2.4.2. Khảo sát sự tăng trưởng của tế bào thu được từ mảnh mô . 28
2.2.5. Khảo sát sự bám dính và tăng sinh của tế bào tủy răng trên giá thể
ngà đã xử lý . 29
2.2.5.1. Phương pháp đưa tế bào lên giá thể . 29
2.2.5.2. Phương pháp MTT 30
2.2.5.3. Phương pháp SEM 31

Chương 3. KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN
3.1. Thu nhận và xử lý giá thể từ mô ngà răng người 32
3.1.1. Thu nhận các mẫu ngà từ thân răng người 32
3.1.2. Đánh giá kết quả xử lí bề mặt của giá thể ngà răng . 32
3.2. Kết quả nuôi cấy tế bào gốc từ tủy răng người . 36
3.2.1. Kết quả nhuộm Hematoxylin – Eosin (H&E) mô tủy răng. . 36
3.2.2. Kết quả nuôi cấy sơ cấp 37
3.2.3. Kết quả cấy chuyền tế bào 40
3.3. Kết quả đánh giá tế bào thu được từ tủy răng. . 41
3.3.1. Sự biểu hiện một số marker của tế bào gốc trung mô. . 41
3.3.2. Kết quả đánh giá sự tăng sinh của tế bào trên bề mặt nuôi cấy 42
3.4. Kết quả khảo sát sự tăng sinh của tế bào tủy răng trên bề mặt giá thể 44
3.5. Khả năng bám của tế bào gốc tuỷ răng trên giá thể 46

Chương 4. KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ
Kết luận 48

Kiến nghị 48
Danh mục công trình của tác giả viii
Tài liệu tham khảo ix
Phụ lục

ĐẶT VẤN ĐỀ

Các bệnh về răng miệng như sâu răng, bệnh lý tủy răng và nha chu là các loại bệnh phổ biến nhất nhưng cũng ít được chú ý, đề phòng nhất ở Việt Nam hiện nay. Trong khi Việt Nam có tới 90% dân số mắc các bệnh về răng miệng.
Khác với các bệnh khác, người ta có thể mắc bệnh răng miệng ngay từ lúc mới sinh cho đến khi sắp từ giã cõi đời, bệnh ảnh hưởng lớn đến sức khỏe do không được chăm sóc và điều trị đúng cách, dẫn đến rụng răng, hạn chế khả năng nói và nhai của con người và mất răng sớm, từ đó làm giảm chất lượng cuộc sống. Do tính chất phổ biến với mọi lứa tuổi như vậy mà việc phòng chống và chữa trị các bệnh về răng miệng là một nhiệm vụ có tính xã hội hoá cao.
Ngày nay, với sự tiến bộ của công nghệ trong thế kỷ 21, người ta mong đợi sẽ giữ được răng tự nhiên hoặc thay thế răng chức năng trong suốt cuộc đời họ. Các kỹ thuật nha khoa hiện nay như phương pháp trám ống tủy (loại bỏ tủy hư) và cấy ghép răng (implant) giúp tăng tỷ lệ thành công trong việc giữ răng, nhưng răng của nhiều người không phục hồi chức năng hoàn toàn; đồng thời, các phương pháp điều trị này đòi hỏi phải tuân theo những nguyên tắc nghiêm ngặt, kỹ thuật phức tạp, theo dõi và chăm sóc răng định kỳ nên các nhà khoa học trên thế giới đã và đang hướng đến nghiên cứu những phương pháp nhằm tái tạo răng.
Đã có nhiều công trình trên thế giới tiến hành nghiên cứu phân lập và nuôi cấy tế bào gốc tủy răng cũng như tạo khung nâng đỡ, dùng để phục hồi tủy răng trong chữa trị mà không cần loại bỏ hoàn toàn tủy răng. Khi đó, tế bào tủy răng đã được nuôi trên giá thể polymer tổng hợp như giá thể alginate, giá thể polymer poly (lactic-co-glycolic) acid, giá thể composite và giá thể polymer tự nhiên dùng trong công nghệ nội nha như collagen. Tuy nhiên, sự phân hủy các polymer tổng hợp, cả trong điều kiện in vitro và in vivo, giải phóng các sản phẩm phụ khiến cho vi môi trường giá thể không lý tưởng cho sự tăng trưởng mô, có hại đến chức năng của tế bào và các polymer tự nhiên có thể gây ra các đáp ứng miễn dịch.
Để khắc phục nhược điểm của các giá thể polymer tự nhiên và polymer tổng hợp, hiện nay, các nhà khoa học hướng tới việc sử dụng ngà răng. Ưu điểm của giá



thể ngà là giá thể tự nhiên, chi phí thấp, nguồn mẫu thu dồi dào và hỗ trợ sự bám dính, tăng sinh của tế bào gốc tủy răng người. Ngoài ra, giá thể ngà đã được chứng minh có khả năng kích thích tế bào tủy răng người biệt hóa thành nguyên bào ngà in vitro và hình thành nên ngà mới in vivo.
Những thành tựu gần đây đã mở ra một triển vọng về xây dựng một quy trình tái tạo mô tủy và hình thành lớp ngà mới, nhằm để tái tạo phức hợp ngà - tủy ứng dụng trong chữa trị nội nha lâm sàng. Với sự phát triển không ngừng và kết hợp của nhiều ngành khoa học, các ứng dụng của kỹ nghệ mô ngày càng phong phú như da, xương, mạch máu, thần kinh và răng. Trong đó, việc lựa chọn giá thể thích hợp là mục tiêu cần thiết để thành công trong việc tạo mô và cơ quan thay thế.
Với những tiềm năng ứng dụng to lớn như trên, đề tài luận văn này được tiến hành nhằm mục tiêu “Thu nhận và xử lý ngà răng người làm giá thể nuôi cấy tế bào gốc”. Các kết quả thu được như một bước khởi đầu cho những nghiên cứu sau này trong lĩnh vực chữa trị và phục hồi nha khoa lâm sàng.
Mục tiêu chuyên biệt

- Thu nhận và xử lý được giá thể từ ngà răng người
- Nuôi cấy và nhận diện được tế bào gốc tủy răng người
- Đánh giá được sự bám dính và tăng sinh của tế bào tủy răng người trên giá thể ngà đã xử lý.

1.1. Kỹ nghệ mô [4], [46]

Kỹ nghệ mô là ngành khoa học mới kết hợp nhiều lĩnh vực như sinh học tế bào, khoa học vật liệu, giải phẫu, để tạo ra các mô, cơ quan có chức năng, sử dụng tế bào sống và một chất nền hay còn gọi là giá thể.
Kỹ nghệ mô đã khắc phục những hạn chế của phương pháp điều trị truyền thống bằng cách tạo ra các mô, cơ quan nhân tạo có tính tương hợp sinh học và không gây ra các phản ứng thải loại.
Các tế bào được nuôi cấy theo phương pháp truyền thống có thể tăng trưởng tạo lớp đơn nhưng không thể tổ chức thành mô hay cơ quan được. Bởi vì, chúng thiếu các tín hiệu cơ học, tín hiệu điện và các thành phần cấu trúc, hóa học từ thành phần ngoại bào giống như môi trường in vivo (thành phần cấu trúc giống chất nền ngoại bào của mô hay cơ quan). Do đó, để tạo ra mô hay cơ quan nhân tạo phải thỏa mãn những yêu cầu sau: giá thể, tế bào, nhân tố tăng trưởng thích hợp và điều kiện nuôi cấy tối ưu. Trong đó, giá thể là một thành phần rất quan trọng trong kỹ nghệ mô.