Thạc Sĩ Thu nhận và tinh sạch phytase ngoại bào từ nấm men sporobolomyces japonicus

MỞ ĐẦU

Khoảng 60-90% phospho có nguồn gốc từ thực vật (ngũ cốc, hạt dầu, cây họ đậu, tồn tại ở dạng acid phytic hoặc phytate). Phytate là muối của acid phytic, động vật không thể hấp thu được như heo, cá, những động vật thiếu enzyme đường ruột cho sự khử phospho của phức hợp phytate.
Bên cạnh đó lượng phytate thải ra môi trường quá nhiều, thì sự hòa tan thấp của phosphate và quá trình chuyển nhanh chóng của nó thành dạng không tan đã làm cho nguyên tố này trở thành một chất dinh dưỡng tăng trưởng hạn chế trong hệ sinh thái nước ngọt.
Do đó các nhà khoa học và các nhà doanh nghiệp làm việc trong lĩnh vực bảo vệ môi trường, dinh dưỡng cho động vật và sức khỏe cho con người đã dần quan tâm đến enzyme phytase. Phytase được xếp vào nhóm phosphohydrolase-enzyme thủy phân gốc phospho, xúc tác giải phóng phospho từ phytate, là thành phần phospho hữu cơ chủ yếu trong hạt và ngũ cốc. Enzyme này được bổ sung vào thức ăn cho động vật, và tiềm năng của nó trong việc cung cấp dinh dưỡng cho con người và trong lĩnh vực khác như nuôi trồng thủy sản. Các xu hướng thương mại gần đây cho thấy rõ tầm quan trọng của phytase như là một chất bổ sung vào trong thức ăn cho gia súc.
Nghiên cứu phytase tuy không phải là mới mẻ, tuy nhiên việc tìm kiếm ra các đối tượng mới có khả năng tổng hợp phytase sẽ tạo nên nguồn phong phú và tạo điều kiện để nghiên cứu sâu những đặc tính sinh hóa của phytase từ các nguồn khác nhau.
Nghiên cứu phytase nấm men có thể quan trọng với nhiều nguyên nhân. Do phytase nấm mốc đặc biệt là Aspergillus spp, đã được nghiên cứu khá nhiều do ứng dụng của chúng trong bổ sung vào thức ăn chăn nuôi làm tăng hàm lượng phospho và các khoáng chất. Tuy nhiên, trong thực phẩm cho con người, thì phytase không có sẵn. Nhờ vào khả năng hầu như không gây bệnh, nấm men được chọn làm nguồn sản xuất phytase để ứng dụng trong thực phẩm cho con người.
Và trong nội dung của đề tài này chúng tôi nhắm đến những vấn đề như sau:
Chọn giống vi sinh vật sinh phytase
Khảo sát các điều kiện nuôi cấy tối ưu để thu nhận phytase từ nấm men
Khảo sát các điều kiện tối ưu để thu nhận và tinh sạch phytase
Nghiên cứu các đặc tính của phytase tinh sạch
MỤC LỤC

Trang phụ bìa
Mục lục
Lời cảm ơn
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình vẽ, đồ thị
MỞ ĐẦU 1
Chương 1: Tổng quan tài liệu .3
1.1 Acid phytic .3
1.2 Phytate .4
1.3 Nguyên tố phospho .7
1.4 Giới thiệu về phytase 8
1.4.1 Danh pháp phytase .9
1.4.2 Phản ứng xúc tác của phytase .10
1.4.3 Các đối tượng tổng hợp phytase .11
1.4.4 Sự khác biệt các vi sinh vật sinh phytase .12
1.4.5 Đặc điểm phytase nấm men .14
1.4.5.1 Vị trí sản sinh phytase của nấm men 15
1.4.5.2 Các tác nhân ảnh hưởng đến hoạt tính phytase 15
1.4.6 Con đường khử phosphoryl hóa phytate 18 1.4.7 Chế phẩm Myo-inositol 19
1.4.8 Phân loại Sporobolomyces japonicus .21
1.4.9 Ứng dụng phytase trong thức ăn chăn nuôi .21
1.4.10 Ứng dụng phytase trong thực phẩm .21
1.4.11 Tiềm năng trong ngành thủy sản 22
1.4.12 Định hướng tương lai 23
Chương 2: Vật Liệu & Phương Pháp: 24
2.1 Vật liệu: .24
2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 24
2.1.2 Dụng cụ và thiết bị .24
2.1.3 Hóa chất và cách pha dung dịch hóa chất .24
2.1.3.1 Hóa chất .24
2.1.3.2 Cách pha dung dịch hóa chất 26
2.1.4 Thành phần môi trường nuôi cấy và cách pha các môi trường 32
2.1.4.1 Môi trường hoạt hóa và giữ giống .32
2.1.4.2 Môi trường chọn lọc nấm men sinh tổng hợp phytase 32
2.1.4.3 Môi trường lên men sinh tổng hợp phytase 32
2.2 Các phương pháp sử dụng: 33
2.2.1 Phương pháp xác định hoạt độ phytase 33
2.2.1.1 Dựng đường chuẩn phospho 33
2.2.1.2 Xác định lượng phospho trong dung dịch nghiên cứu 34
2.2.2 Phương pháp xác định hàm lượng protein .35
2.2.3 Phương pháp sắc ký lọc gel .36
2.2.4 Phương pháp điện di SDS PAGE 39
2.3 Phương pháp nghiên cứu: .43
2.3.1 Hoạt hóa và giữ giống: .43
2.3.1.1 Bảo quản giống trên môi trường thạch nghiêng 43
2.3.1.2 Bảo quản giống trên môi trường YPD 20% glycerol 43
2.3.2 Chọn giống vi sinh vật sinh phytase 44
2.3.3 Thu nhận dịch chiết thô enzyme .44
2.3.4 Xác định hoạt độ phytase của các chủng nấm men có vòng phân giải lớn - chọn chủng nấm men có hoạt độ phytase cao nhất 44
2.3.5 Chọn lọc môi trường thích hợp cho nấm men sinh phytase
cao nhất 44
2.3.6 Khảo sát thời gian nuôi cấy .45
HVTH: Trịnh Phong Vân CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh
Luận Văn Thạc Sĩ Mục lục
2.3.7 Khảo sát tỉ lệ giống thích hợp cho quá trình lên men sinh phytase 45
2.3.8 Tủa enzyme 45
2.3.8.1 Kết tủa bằng muối .45
2.3.8.2 Kết tủa bằng dung môi hữu cơ 46
2.3.9. Khảo sát ảnh hưởng của các tác nhân tủa lên hoạt độ phytase .47
2.3.10 Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi lên hoạt độ phytase .47
2.3.11 Khảo sát ảnh hưởng thời gian tủa lên hoạt độ phytase .47
2.3.12 Khảo sát ảnh hưởng pH lên hoạt độ phytase .47
2.3.13 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt độ phytase .48
2.3.14 Khảo sát tính bền nhiệt của phytase .48
2.3.15 Khảo sát tính bền nhiệt và ổn định pH của phytase 48
2.3.16 Khảo sát ảnh hưởng của các ion kim loại lên hoạt độ phytase .48
2.3.17 Tinh sạch phytase thu được bằng phương pháp sắc ký lọc gel 48
2.3.18 Phương pháp xác định hằng số Km .49
Chương 3: Kết Quả & Biện Luận .52
3.1 Chọn giống vi sinh vật sinh phytase .52
3.2 Xác định hoạt độ phytase sơ bộ của các chủng nấm men có vòng phân giải lớn từ đó chọn ra chủng nấm men có hoạt độ phytase cao nhất 54
3.3. Chọn lọc môi trường thích hợp cho nấm men sinh phytase cao nhất .56
3.4. Khảo sát thời gian nuôi cấy 57
3.5. Khảo sát tỉ lệ giống thích hợp cho quá trình lên men sinh phytase
.59
3.6. Thu nhận protein enzyme bằng các tác nhân tủa .60
3.6.1 Tác nhân tủa là cồn 96o 60
3.6.2 Tác nhân tủa là acetone 61
3.6.3 Tác nhân tủa là muối amonium sulfate 62
3.7. Ảnh hưởng của thời gian tủa lên hoạt độ phytase 64
3.8. Kiểm tra sự hiện diện của phytase bằng điện di SDS-PAGE 66
3.9 Khảo sát ảnh hưởng pH lên hoạt độ phytase 67
3.10 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt độ phytase .70
3.11 Khảo sát tính bền nhiệt của phytase 72
3.12 Khảo sát tính bền nhiệt và ổn định pH của phytase .75
3.13 Khảo sát ảnh hưởng của các ion kim loại lên hoạt độ phytase 75
3.14 Sắc ký tinh sạch enzyme : Sử dụng sắc ký lọc gel .79
3.15 Xác định hoạt độ tổng, hoạt độ riêng của phytase sau sắc ký, hiệu suất thu hồi hoạt độ, hiệu suất thu hồi protein 81
3.16 Xác định hằng số Km phản ứng enzyme – cơ chất Na-phytate 82
3.17 Kiểm tra độ tinh sạch của phytase sau sắc ký – xác định trọng lượng phân tử phytase của Sporobolomyces japonicus 85
Chương 4: Kết luận & Đề nghị .89
4.1 Kết luận 89
4.2 Đề nghị .90
Tài liệu tham khảo: .91
Phụ lục: .94