Báo Cáo Thu nhận và biệt hóa tế bào gốc trung mô từ máu cuống rốn người

TÓM TẮT: Máu cuống rốn chứa một nguồn tế bào gốc trung mô (Mesenchymal stem cell - MSC) dồi dào. Các MSC này có thể được thu nhận và nuôi cấy trong môi trường IMDM, 10% FBS. Sau khoảng 7 ngày nuôi cấy, các MSC tăng sinh mạnh và chiếm 70-80% bề mặt bình nuôi, tiến hành cấy chuyền với trypsin/EDTA 0,25% nhằm cung cấp chất dinh dưỡng và không gian phát triển cho MSC.
MSC là tế bào gốc đa năng (Multipotential stem cell), chúng có khả năng biệt hoá (Differentiation) thành rất nhiều kiểu tế bào chức năng khác nhau như xương, mỡ, sụn, thần kinh, gan khi được nuôi trong môi trường có tác nhân biệt hóa thích hợp.
Từ khóa: tế bào gốc trung mô, máu cuống rốn, tế bào gốc đa năng


1. MỞ ĐẦU


Tế bào gốc (stem cell) nói chung và tế bào gốc trung mô nói riêng, hiện đã và đang được nhiều nhà khoa học quan tâm vì khả năng đặc biệt và duy nhất của chúng. Đó là khả năng tự làm mới (self renewal) trong một thời gian dài và biệt hoá thành nhiều kiểu tế bào khác nhau trong cơ thể như xương, sụn, mỡ, tế bào thần kinh . [1]. Do đó, chúng có tiềm năng to lớn trong việc cấy ghép để điều trị bệnh (đặc biệt là các bệnh do sự suy thoái tế bào) và trong công nghệ mô (Tissue engineering).
Các giá trị ứng dụng to lớn của tế bào gốc trong y học đã mở ra hướng trị liệu mới: Y học phục hồi (Regenerative medicine) thông qua Liệu pháp tế bào gốc (Stem cell therapy).


2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1.Thu nhận máu cuống rốn
Máu cuống rốn được thu nhận từ các sản phụ đã được xét nghiệm âm tính với HIV, HBV,
HCV ở Bệnh viện Hùng Vương Thành phố Hồ Chí Minh.
Sau khi thai nhi vừa được sinh ra, tiến hành kẹp phần cuống rốn gần bụng và cắt trên vị trí kẹp 1 cm. Dùng kim tiêm của túi thu máu (có chứa sẵn chất chống đông máu) đưa vào cuống rốn ở vị trí gần nhau thai. Máu cuống rốn sẽ theo kim và ống dẫn chảy vào túi thu máu. Khi máu hết chảy, rút kim ra và mang túi chứa máu về phòng thí nghiệm (được bảo quản lạnh trong đá gel). Thời gian từ khi thu nhận máu đến khi thao tác trong vòng 2 giờ.


2.2. Giai đoạn 1, nuôi cấy sơ cấp tế bào của máu cuống rốn: chọn lọc MSC
Về nguyên tắc, máu trong cuống rốn luôn chứa ba loại tế bào chính: tế bào gốc tạo máu (Hemapoietic Stem Cell_HSC), tế bào máu trưởng thành và MSC. Các MSC và tế bào gốc tạo máu thuộc quần thể các tế bào đơn nhân. Tiến hành thu nhận quần thể tế bào đơn nhân bằng phương pháp li tâm trên gradient nồng độ Ficoll-paque (Sigma) ở tốc độ 2.500 vòng/phút, trong 5 phút. Sau đó, thu nhận phân đoạn chứa các tế bào đơn nhân nằm giữa lớp Ficoll-paque và lớp huyết tương bên trên. Trong quá trình li tâm, các tế bào đã biệt hóa với kích thước lớn


Trang 5



hơn sẽ đi xuyên qua lớp Ficoll và lắng ở đáy ống li tâm. Các tế bào hồng cầu không nhân nhẹ, nằm trong lớp huyết tương bên trên. Và các tế bào đơn nhân với kích thước trung bình luôn nằm ở lớp giữa.
MSC sẽ được tách khỏi tế bào gốc tạo máu trong quần thể tế bào đơn nhân bằng phương pháp nuôi cấy. Trong nuôi cấy, các MSC sẽ bám dính vào bề mặt (giá thể) nuôi cấy, trong khi đó tế bào gốc tạo máu không có khả năng này.
Tế bào đơn nhân sau khi thu nhận được huyền phù trong môi trường nuôi cấy IMDM, 10% FBS, nuôi trong bình nuôi cấy (Nunc, 25 cm2) sao cho đạt mật độ 3.105 tế bào/cm2 ở điều kiện 370C, 5% CO2. Sau 48 giờ, các MSC bắt đầu bám trên bề mặt đáy của bình nuôi, thay môi trường để loại bỏ hết các tế bào không bám (các tế bào chết và tế bào gốc tạo máu), tiếp tục nuôi cho đến khi tế bào mọc đạt tỷ lệ 70-80% bề mặt đáy bình nuôi, với chế độ thay môi trường là 7 ngày/lần.


2.3. Giai đoạn 2, nuôi cấy thứ cấp: cấy chuyền tăng sinh MSC
Khi mật độ MSC trong bình nuôi tăng, đạt khoảng 70-80% tỷ lệ diện tích đáy bình, tiến hành cấy chuyền nhằm cung cấp không gian và chất dinh dưỡng cho MSC.
Quy trình được tiến hành như sau: loại bỏ môi trường cũ và rửa tế bào với 4-5 ml PBSA có bổ sung gentamycin (10 µg/ml) hai lần. Tiếp tục loại bỏ dịch rửa và bổ sung 4-5 ml trypsin/EDTA 0,05%. Sau 15 giây, tiến hành đổ bỏ dung dịch enzyme nhưng vẫn giữ lại khoảng 1 ml và tiếp tục ủ trong tủ ấm 370C, từ 2-3 phút. Sau đó, lắc nhẹ bình nuôi cấy để tách tế bào ra khỏi bề mặt đáy. Khi tế bào co tròn và tách ra khỏi bề mặt bình nuôi, phải trung hòa trypsin thừa bằng 10-11 ml môi trường IMDM 10% FBS. Huyền phù tế bào đó được chia đều cho 3 bình nuôi mới.


2.4. iệt hoá MSC


Các MSC được thu nhận theo phương pháp trên, sau khi cấy chuyền từ 5-7 lần, tiến hành kiểm tra độ tinh sạch, tạo nồng độ thích hợp để cuối cùng sử dụng cho biệt hóa in vitro.


2.4.1. ệt hóa MSC thành tế bào tạo mỡ (adipocyte)
Để biệt hóa thành tế bào tạo mỡ, các MSC có nồng độ chuẩn được nuôi trong môi trường IMDM 10% FBS có bổ sung 1 àM dexamethasone, 200 àM indomethacin, 1,7 àM insuline,
500 àM isobutyl-methylxanthine (IBMX) (Sigma). Trong đó, dexamethasone là một
glucocorticoid steroid có tác dụng cảm ứng cho sự biệt hóa và các yếu tố bổ sung còn lại sẽ kích thích sự biệt hóa. Insuline sẽ kích thích sự thu nhận các phân tử glucose vào tế bào, tạo nguyên liệu cho các phản ứng chuyển hóa thành các giọt mỡ [10;11]. IBMX là chất ức chế phosphodiesterase làm khóa sự chuyển cAMP thành 5’AMP [8]. Điều này gây nên sự điều hòa dương tính hormone nhạy cảm lipase (HSL). HSL sẽ chuyển triacyl glyceride thành glycerol và acid béo tự do, đây chính là quá trình tạo mỡ [8]. Indomethacin là ligand của PPAR (peroxisome proliferators-activated receptor) làm hoạt hóa một nhân tố phiên mã ức chế tín hiệu Wnt, cần thiết cho sự biệt hóa thành mỡ [8;13].
Sự biệt hóa được ghi nhận khi quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại X20, X40 thấy có sự xuất hiện các giọt mỡ nhỏ. Các tế bào tạo mỡ còn được xác định dựa vào phương pháp nhuộm với thuốc nhuộm Oil red (Merck). Oil red là thuốc nhuộm lipid, nó chỉ hòa tan trong lipid và tạo màu đỏ.


2.4.2. Biệt hoá MSC thành nguyên bào xương (Osteoblast)
Các MSC có nồng độ chuẩn được nuôi trong môi trường IMDM 10% FBS có bổ sung 100 nM dexamethasone, 50 àg/ml L-ascorbic acid 2-phosphat (AsAP) và 100 mM β-



glycerolphosphate (Sigma). Dexamethasone có khả năng hoặc kích thích hoặc ức chế sự biệt hóa thành xương phụ thuộc vào nồng độ của nó. Nồng độ cao của dexamethasone sẽ cảm ứng biệt hóa thành mỡ, trong khi đó, với nồng độ thấp hơn, chất này sẽ kích thích MSC biệt hóa thành xương [2]. AsAP làm dễ dàng quá trình biệt hóa thành xương, bao gồm kích thích sự tổng hợp collagen, ngoài ra nó còn có tác động tăng sinh tế bào [5;6;9]. Cuối cùng, β- glycerolphosphate là yếu tố quan trọng kích thích sự hình thành chất nền được khoáng hóa khi kết hợp với dexamethasone và AsAP [9].
Sau 7-14 ngày nuôi cấy, sự biệt hoá được đánh giá thông qua khả năng tích tụ của calcium trong chất nền nhờ phương pháp nhuộm với thuốc nhuộm Alizarin Red (Sigma).