Thạc Sĩ Thu nhận tế bào gốc từ mô nhung hươu sao việt nam (Cervus nippon pseudaxis)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2010


MỤC LỤC ( Luận văn dài 87 trang có File WORD)

Trang MỤC LỤC .i
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ .iv
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT .v
DANH MỤC BẢNG vii
DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ viii
MỞ ĐẦU 1

Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Khái quát về nhung hươu .3
1.1.1. Sơ lược về hươu sao Việt Nam 3
1.1.2. Sinh học nhung hươu 4
1.1.2.1. Khái niệm .4
1.1.2.2. Các giai đoạn phát triển của sừng hươu .4
1.1.2.3. Thành phần hóa học chính trong nhung hươu .6
1.1.3. Một số tác dụng dược lý của nhung hươu 6
1.2. Tình hình nghiên cứu nhung hươu trong và ngoài nước .8
1.2.1. Các nghiên cứu về nhung hươu thực hiện ở Việt Nam .8
1.2.2. Các nghiên cứu về nhung hươu thực hiện trên thế giới .10
1.3. Tế bào gốc nhung hươu và tiềm năng ứng dụng của tế bào 12
1.3.1. Khái quát về tế bào gốc 12
1.3.2. Tế bào gốc nhung hươu – lược sử nghiên cứu và 13


Chương 2. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP

2.1. Vật liệu nghiên cứu và tiến trình nghiên cứu 19
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu .19
2.1.2. Tiến trình nghiên cứu 19
2.2. Dụng cụ và thiết bị .20
2.3. Hóa chất 21
2.4. Các phương pháp thực nghiệm 25
2.4.1. Phương pháp thu nhận mẫu mô nhung hươu .25
2.4.2. Thu nhận tế bào đơn từ mẫu mô nhung hươu .26
2.4.3. Nuôi cấy tế bào đơn .28
2.4.4. Phương pháp nuôi cấy tăng sinh tế bào và cấy chuyền .28
2.4.4.1. Quy trình cấy chuyền tế bào 28
2.4.4.2. Phương pháp xác định các chỉ số tế bào 29
2.4.5. Chứng minh các tế bào thu nhận từ mẫu mô .30
2.4.5.1. Kiểm chứng khả năng tăng sinh dài hạn – khả năng . 30
2.4.5.2. Kiểm chứng khả năng biệt hóa 30

Chương 3. KẾT QUẢ – BIỆN LUẬN

3.1. Kết quả thu nhận mẫu mô nhung hươu 34
3.2. Kết quả thu nhận tế bào đơn từ mẫu mô nhung hươu 35
3.3. Kết quả nuôi cấy sơ cấp tế bào nhung hươu .37
3.4. Kết quả cấy chuyền và nuôi cấy tăng sinh tế bào nhung hươu .43
3.5. Kết quả chứng minh tính gốc của các tế bào .50
3.5.1. Khả năng tăng sinh dài hạn – khả năng tự làm mới .50

3.5.2. Khả năng biệt hóa 51
3.5.2.1. Kết quả biệt hóa thành tế bào tạo xương .51
3.5.2.2. Kết quả biệt hóa thành tế bào tạo mỡ 54
3.6. Biện luận chung .57

Chương 4. KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ

4.1. Kết luận 64
4.2. Đề nghị 65

TÀI LIỆU THAM KHẢO . 66



DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1. Hươu sao và nhung hươu 3
Hình 1.2. Mặt cắt vùng đỉnh đang tăng trưởng của nhung hươu 14
Hình 1.3. Các tế bào STRO – 1+ trong những vùng khác nhau của cuống .17
Hình 2.1. Sơ đồ mô tả các nội dung nghiên cứu .19
Hình 2.2. Mẫu mô nhung hươu sao .20
Hình 2.3. Phần ngọn của nhung hươu .25
Hình 2.4. Quy trình đông lạnh mẫu mô nhung hươu 26
Hình 2.5. Quy trình thu nhận tế bào đơn từ mẫu mô nhung hươu 27
Hình 2.6. Quy trình nuôi cấy tế bào đơn .28
Hình 2.7. Quy trình cấy chuyền tế bào .29
Hình 2.8. Quy trình biệt hóa tế bào .30
Hình 2.9. Quy trình nhuộm Alizarin Red S 31
Hình 2.10. Quy trình nhuộm Oil Red O 33
Hình 3.1. Phần ngọn của nhung hươu .34
Hình 3.2. Mẫu mô nhung hươu được cắt thành những mảnh nhỏ 34
Hình 3.3. Các mảnh mô nhung hươu có kích thước 2 – 4 mm2 35
Hình 3.4. Các tế bào đơn thu nhận từ mô nhung hươu .37
Hình 3.5. Tế bào nhung hươu sau 24 giờ nuôi cấy .38
Hình 3.6. Tế bào nhung hươu sau 48 giờ nuôi cấy .39
Hình 3.7. Tế bào nhung hươu sau 72 giờ nuôi cấy .40
Hình 3.8. Tế bào nhung hươu sau 4 ngày nuôi cấy .41
Hình 3.9. Tế bào nhung hươu sau 7 ngày nuôi cấy .41

Hình 3.10. Tế bào nhung hươu sau 10 ngày nuôi cấy .42
Hình 3.11. Tế bào nhung hươu sau khi cấy chuyền 0 giờ .44
Hình 3.12. Tế bào nhung hươu sau khi cấy chuyền 24 giờ .45
Hình 3.13. Tế bào nhung hươu sau khi cấy chuyền ngày 7 45
Hình 3.14. Tế bào nhung hươu qua 2 lần cấy chuyền .46
Hình 3.15. Tế bào nhung hươu qua 3 lần cấy chuyền .46
Hình 3.16. Tế bào nhung hươu qua 4 lần cấy chuyền .47
Hình 3.17. Tế bào nhung hươu qua 5 lần cấy chuyền .47
Hình 3.18. Các tế bào nhung hươu trước khi bắt đầu cảm ứng biệt hóa 51
Hình 3.19. Các tế bào nhung hươu sau 15 ngày 52
Hình 3.20. Các tế bào nhung hươu sau 20 ngày .52
Hình 3.21. Các tế bào nhung hươu sau 20 ngày .53
Hình 3.22. Các tế bào nhung hươu tích tụ giọt mỡ 55
Hình 3.23. Các tế bào nhung hươu sau 20 ngày 55
Hình 3.24. Các giọt mỡ tích tụ trong tế bào chất .56
Hình 3.25. Các tế bào nhung hươu sau 20 ngày .56
Hình 3.26. Tế bào nhung hươu 58
Hình 3.27. Tế bào nhung hươu 58
Hình 3.28. Tế bào nhung hươu sau khi cảm ứng biệt hóa tạo xương .60
Hình 3.29. Tế bào nhung hươu sau khi cảm ứng biệt hóa tạo mỡ .61
Hình 3.30. Tế bào nhung hươu 62

Đồ thị 3.1. Sự tăng trưởng của tế bào nhung hươu .48
Đồ thị 3.2. Đường cong tăng trưởng của tế bào nhung hươu dựa trên .49



DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Danh mục các dụng cụ sử dụng trong đề tài .20
Bảng 2.2. Danh mục các thiết bị sử dụng trong đề tài 21
Bảng 2.3. Danh mục các hóa chất sử dụng trong đề tài 21
Bảng 3.1. Kết quả thu nhận tế bào đơn từ mẫu mô nhung hươu tươi .36
Bảng 3.2. Kết quả thu nhận tế bào đơn từ mẫu mô nhung hươu đông lạnh .36
Bảng 3.3. Số lượng mẫu nuôi sơ cấp 38
Bảng 3.4. Kết quả nuôi cấy sơ cấp tế bào thu nhận từ nhung hươu 42
Bảng 3.5. Kết quả nuôi tăng sinh tế bào nhung hươu .48




DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1. Hươu sao và nhung hươu 3
Hình 1.2. Mặt cắt vùng đỉnh đang tăng trưởng của nhung hươu 14
Hình 1.3. Các tế bào STRO – 1+ trong những vùng khác nhau của cuống .17
Hình 2.1. Sơ đồ mô tả các nội dung nghiên cứu .19
Hình 2.2. Mẫu mô nhung hươu sao .20
Hình 2.3. Phần ngọn của nhung hươu .25
Hình 2.4. Quy trình đông lạnh mẫu mô nhung hươu 26
Hình 2.5. Quy trình thu nhận tế bào đơn từ mẫu mô nhung hươu 27
Hình 2.6. Quy trình nuôi cấy tế bào đơn .28
Hình 2.7. Quy trình cấy chuyền tế bào .29
Hình 2.8. Quy trình biệt hóa tế bào .30
Hình 2.9. Quy trình nhuộm Alizarin Red S 31
Hình 2.10. Quy trình nhuộm Oil Red O 33
Hình 3.1. Phần ngọn của nhung hươu .34
Hình 3.2. Mẫu mô nhung hươu được cắt thành những mảnh nhỏ 34
Hình 3.3. Các mảnh mô nhung hươu có kích thước 2 – 4 mm2 35
Hình 3.4. Các tế bào đơn thu nhận từ mô nhung hươu .37
Hình 3.5. Tế bào nhung hươu sau 24 giờ nuôi cấy .38
Hình 3.6. Tế bào nhung hươu sau 48 giờ nuôi cấy .39
Hình 3.7. Tế bào nhung hươu sau 72 giờ nuôi cấy .40
Hình 3.8. Tế bào nhung hươu sau 4 ngày nuôi cấy .41
Hình 3.9. Tế bào nhung hươu sau 7 ngày nuôi cấy .41

Hình 3.10. Tế bào nhung hươu sau 10 ngày nuôi cấy .42
Hình 3.11. Tế bào nhung hươu sau khi cấy chuyền 0 giờ .44
Hình 3.12. Tế bào nhung hươu sau khi cấy chuyền 24 giờ .45
Hình 3.13. Tế bào nhung hươu sau khi cấy chuyền ngày 7 45
Hình 3.14. Tế bào nhung hươu qua 2 lần cấy chuyền .46
Hình 3.15. Tế bào nhung hươu qua 3 lần cấy chuyền .46
Hình 3.16. Tế bào nhung hươu qua 4 lần cấy chuyền .47
Hình 3.17. Tế bào nhung hươu qua 5 lần cấy chuyền .47
Hình 3.18. Các tế bào nhung hươu trước khi bắt đầu cảm ứng biệt hóa 51
Hình 3.19. Các tế bào nhung hươu sau 15 ngày 52
Hình 3.20. Các tế bào nhung hươu sau 20 ngày .52
Hình 3.21. Các tế bào nhung hươu sau 20 ngày .53
Hình 3.22. Các tế bào nhung hươu tích tụ giọt mỡ 55
Hình 3.23. Các tế bào nhung hươu sau 20 ngày 55
Hình 3.24. Các giọt mỡ tích tụ trong tế bào chất .56
Hình 3.25. Các tế bào nhung hươu sau 20 ngày .56
Hình 3.26. Tế bào nhung hươu 58
Hình 3.27. Tế bào nhung hươu 58
Hình 3.28. Tế bào nhung hươu sau khi cảm ứng biệt hóa tạo xương .60
Hình 3.29. Tế bào nhung hươu sau khi cảm ứng biệt hóa tạo mỡ .61
Hình 3.30. Tế bào nhung hươu 62

Đồ thị 3.1. Sự tăng trưởng của tế bào nhung hươu .48
Đồ thị 3.2. Đường cong tăng trưởng của tế bào nhung hươu dựa trên .49


ĐẶT VẤN ĐỀ

Nhung hươu là một vị thuốc quý , thu hút được nhiều sự chú ý của các nhà khoa học . Thông thường , các công trình nghiên cứu chủ yếu tập trung vào thành phần hóa học cũng như tác dụng dược lý của nhung hươu. Gần đây, hiện tượng tái sinh của sừng hươu – hiện tượng tái sinh duy nhất được tìm thấy ở động vật có vú – lại được quan tâm nhiều hơn, đặc biệt từ phía các nhà khoa học thuộc lĩnh vực y học phục hồi. Nhưng cho đến nay, cơ chế của sự tái sinh sừng hươu vẫn chưa được hiểu rõ.

Trước đây, sự tái sinh của sừng hươu được xem là quá trình tái sinh các bộ phận bị mất giống như sự tái sinh các chi ở lưỡng cư. Trong khi đó, các nghiên cứu gần đây cho r ằng, sự tái sinh của s ừng hươu là một hiện tượng dựa vào tế bào gốc, và phụ thuộc vào sự hoạt động theo chu kỳ của các tế bào gốc nằm trong màng xương cuống. Bằng chứng của giả thuyết này đã đư ợc xem xét và kết quả thu được cho thấy sự tái sinh của sừng hươu không liên quan tới sự phản biệt hóa hay chuyển biệt hóa của tế bào.

Đặc biệt, năm 2008, Rolf và cộng sự tại Trường Đại học Goettingen (Goettingen, Đức) đưa ra những bằng chứng về sự tồn tại của các tế bào dương tính với marker STRO – 1 – một protein bề mặt của tế bào trung mô tủy xương hay tế bào tiền thân tạo máu – tại các vùng khác nhau của sừng đang tái sinh và nguyên phát, cũng như trong cuống của sừng hươu. Phân tích FACS (fluorescence activated cell sorting) của các tác giả này chứng minh rằng: nếu nuôi cấy sơ cấp các tế bào từ màng xương cuống hươu đực thì sẽ thu được quần thể tế bào dương tính với STRO
– 1, CD271, CD133. Và các tế bào này có khả năn g biệt hóa thành các dạng tế bào như xương , sụn, mỡ . Do đó, các tế bào này có thể được định nghĩa là các t ế bào tiền thân trung mô. Những kết quả trên chứng minh cho quan điểm sự tái sinh sừng hươu hằng năm là một quá trình được điều khiển bởi tế bào gốc hoặc tế bào tiền thân trung mô nằm ở lớp trong màng xương của sừng.

Từ những nghiên cứu trên , có thể suy luận rằng nhung hươu sao Việt Nam –một loài đặc hữu – cũng chứa các tế bào gốc . Tuy nhiên, các nghiên cứu cụ thể về vấn đề này vẫn chưa được thực hiện . Trên cơ sở đó , chúng tôi đưa ra đề tài “Thu nhận tế bào gốc từ mô nhung hươu sao Việt Nam (Cervus nippon pseudaxis)”.

Ở Việt Nam , nhung hươu đã đư ợc sử dụng từ rất lâu đời, nhưng các nghiên cứu in vitro về tế bào nhung hươu vẫn còn là một lĩnh vực khá mới mẻ. Với mục đích chính là bước đầu tiếp cận nghiên cứu in vitro tế bào nhung hươu, đề tài này được tiến hành với các mục tiêu như sau:

1. Thu nhận và nuôi cấy in vitro các tế bào đơn được phân tách từ vùng mô đang tăng trưởng của nhung hươu sao Việt Nam.
2. Thu nhận các tế bào gốc ứng viên từ các các tế bào đơn nhung hươu được nuôi cấy dài hạn.
3. Chứng minh các tế bào gốc ứng viên thu nhận được từ mô nhung hươu biểu hiện đặc điểm của tế bào gốc.