Thạc Sĩ Thu nhận enzyme chitosanase từ chủng xạ khuẩn Streptomyces griceus(NN2) và ứng dụng để sản xuất đườn

Luận văn thạc sĩ
Đề tài: Thu nhận enzyme chitosanase từ chủng xạ khuẩn Streptomyces griceus(NN2) và ứng dụng để sản xuất đường chitosanoligosaccharide (COS) chức năng
Mô tả bị lỗi font vài chữ, tài liệu thì bình thường

MỤC LỤC
LỜI CAM ðOAN i
LỜI CẢM ƠN ii
MỤC LỤC iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi
DANH MỤC BẢNG vii
DANH MỤC ðỒ THỊ viii
DANH MỤC SƠ ðỒ ix
DANH MỤC HÌNH ix
1. MỞ ðẦU 1
1.1. ðặt vấn ñề 1
1.2. Mục ñích và yêu cầu 2
1.2.1. Mục ñích 2
1.2.2. Yêu cầu 3
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
2.1. Chitosan 4
2.2. Enzyme chitosanase 5
2.2.1. Khối lượng phân tử 5
2.2.2. Khái niệm về enzyme chitosanase 5
2.2.3. Phân loại 6
2.2.4. Nguồn nguyên liệu ñể thu nhận enzyme chitosanase 7
2.2.5. Cơ chế xúc tác của enzyme chitosanase 9
2.2.6. Các yếu tố ảnh hưởng ñến quá trình sinh tổng hợp enzyme
chitosanase từ vi sinh vật 11
2.2.7. Các phương pháp thu nhận và tinh sạch enzym chitosan 17
2.3. Hiệu quả của ñường oligosaccharide chức năng 21
2.4. Chitosan oligosaccharide 23
2.4.1. Cấu trúc hoá học của chitosan oligosaccharide (COS) 23
2.4.2. Tính năng của chitosan oligosaccharide ( COS) 24
2.4.3. Ứng dụng chitosan và COS trong ñời sống 28
2.5. Những hướng sản xuất COStrong công nghiệp 33
2.5.1. Phương pháp hoá học 33
2.5.2. Phương pháp enzyme 34
2.6. Xạ khuẩn Streptomyces griseus(chủng NN2) 35
2.6.1. ðặc ñiểm hình thái của xạ khuẩn 35
2.6.2. Khuẩn ti của xạ khuẩn 35
2.6.3. Khuẩn lạc của xạ khuẩn 36
2.5.4. ðặc ñiểm sinh lí, hóa sinh 36
2.7. Tình hình nghiên cứu, sản xuất enzyme chitosanase và chitosan
oligosaccharide (COS) 36
2.7.1. Trên thế giới 36
2.7.2. Tại Việt Nam 40
3. ðỐI TƯỢNG – NỘI DUNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 42
3.1. ðối tượng nghiên cứu 42
3.2. Nội dung nghiên cứu 42
3.2.1.Thu nhận enzyme chitosanase 42
3.2.2. Thu nhận chitosanoligosaccharide (COS) 42
3.3. Phương pháp nghiên cứu 43
3.3.1. Phương pháp vi sinh 43
3.3.2. Phương pháp hóa sinh 43
3.3.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm 48
3.3.4. Phương pháp thống kê và xử lý kết quả 51
3.3.5. Xây dựng quy trình thu nhận enzyme chitosanase và ñường
chitosanoligosaccharide (COS) 54
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 56
4.1. Kết quả hoạt hóa và ñịnh tính khả năng sinh enzyme chitosanase
của xạ khuẩn Streptomyces griceus(chủng NN2) 57
4.2. Thu nhận enzyme chitosanase 59
4.2.1. Chọn lựa các ñiều kiện môi trường nuôi cấy tối ưu xạ khuẩn
Streptomyces griceus (chủng NN2) ñể sinh tổng hợp chitosanase 59
4.2.2. Thu nhận enzyme thô 65
4.3. Xác ñịnh ñiều kiện tối ưu thu nhận chitosan oligosaccharide (COS) 71
4.3.1. Xác ñịnh ảnh hưởng của ñơn yếu tố ñến sự hình thành ñường
COS 71
4.3.2. Xác ñịnh các ñiều kiện ảnh hưởng ñến sự hìnhthành ñường COS
theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm 77
4.4. Quy trình sản xuất chitosan oligosaccharide sử dụng enzyme
chitosanase 83
5. KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 86
5.1. Kết luận 86
5.2. ðề nghị 87
TÀI LIỆU THAM KHẢO 88
PHỤ LỤC 96

1. MỞ ðẦU
1.1. ðặt vấn ñề
Thế kỷ 21 là thế kỷ của công nghệ sinh học (CNSH), nó sẽ xâm nhập
vào mọi lĩnh vực của ñời sống. Công nghệ sinh học có ba cấp ñộ khác nhau:
Công nghệ sinh học truyền thống như các hoạt ñộng chế biến thực phẩm
(rượu, giấm, sữa chua, dưa muối, men bánh mì .), ủphân, phơi ải ñất Công
nghệ sinh học cận ñại với việc sản xuất ở quy mô công nghiệp các sản phẩm
công nghệ lên men, công nghệ vi sinh vật (cồn, bia, dung môi hữu cơ, chất
kháng sinh, bột ngọt, thuốc trừ sâu sinh học ). Công nghệ sinh học hiện ñại chỉ
mới xuất hiện trong vài thập kỷ gần ñây. Công nghệ sinh học hiện ñại sử dụng
các kỹ thuật trao ñổi, sửa chữa, tổ hợp hoặc cải tạo vật chất di truyền ở mức ñộ
phân tử ñể tạo ra các protein hay một số sản phẩm khác mà vốn dĩ chúng ta
không tạo ra ñược.
Công nghệ enzyme là một trong bốn bộ phận của công nghệ sinh học.
Trong một vài thập kỷ gần ñây việc nghiên cứu các ứng dụng của enzyme
ngày càng ñược quan tâm và chú trọng. Công nghệ enzyme ñã từng bước làm
thay ñổi và nâng cao chất lượng của một số quá trình công nghệ trong chế
biến thực phẩm cũng như trong nông nghiệp, dược phẩm, y tế .
Hàng năm lượng enzyme ñược sản xuất ra trên thế giới ñạt khoảng trên
300000 tấn với trị giá trên 500 triệu USD và ñược phân bố trên các lĩnh vực
khác nhau. Tuy nhiên việc nghiên cứu tìm kiếm các loại enzyme mới, và
nghiên cứu các ñặc ñiểm, tính chất, ứng dụng nó luôn là mục tiêu của các nhà
khoa học. Một trong số các enzyme ñó là enzyme chitosanase.
Chitosanase là một enzyme thủy phân liên kết nội phân tử cơ chất
chitosan. Enzyme chitosanase ñược ứng dụng chủ yếu ñể sản xuất ra chitosan
oligosaccharides (COS).
Chitosan có nhiều ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như công
nghiệp, nông nghiệp, thực phẩm, mỹ phẩm, xử l í nước thải và bảo vệ môi
trường Tuy nhiên, do khối lượng phân tử lớn, mạch phân tử dài, khó tan
trong nước nên người ta ñã tạo ra sản phẩm thuỷ phân của chitosan là
chitosanoligosaccharide (COS) nhằm khắc phục hạn chế, cũng như tăng
cường khả năng ứng dụng cho chitosan. Gần ñây, COS với tính năng ưu việt
của mình ñã ngày càng ñược sản xuất nhiều hơn và ñược ứng dụng rộng rãi
trong nhiều lĩnh vực, ñặc biệt là trong công nghệ thực phẩm với vai trò là
oligosaccharide chức năng.
COS có thể ñược thu nhận bằng phương pháp hoá học. Tuy nhiên,
phương pháp hiệu quả nhất ñể sản xuất sản phẩm này là phương pháp sinh
học sử dụng enzyme chitosanase. Enzyme chitosanase có thể thu nhận ñược
từ nhiều nguồn khác nhau như vi khuẩn, nấm, hay mộtsố thực vật Nhưng
enzyme thu nhận từ xạ khuẩn thường có hoạt tính caohơn cả.
Chính vì những ứng dụng rất thiết thực của enzyme chitosanase và COS
ñến ñời sống của con người chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài:
“Thu nhận enzyme chitosanase từ chủng xạ khuẩn Streptomyces griceus
(NN2) và ứng dụng ñể sản xuất ñường chitosanoligosaccharide (COS)
chức năng”.
1.2. Mục ñích và yêu cầu
1.2.1. Mục ñích
Thu nhận enzyme chitosanase có hoạt tính cao từ xạ khuẩn
Streptomyces griceus (chủng NN2) và ứng dụng ñể thu nhận ñường
chitosanoligosaccharide chức năng.
1.2.2. Yêu cầu
- Xác ñịnh ñiều kiện nuôi cấy tối ưu của chủng xạ khuẩn ñể thu enzyme
chitosanase hoạt tính cao.
- Lựa chọn ñiều kiện thu nhận và tinh chế chế phẩm enzyme chitosanase
thô ñể thu ñược enzyme kỹ thuật.
- Xác ñịnh ñiều kiện tối ưu ñể sản xuất ñường chitosan oligosaccharide
như: pH, nhiệt ñộ và tỷ lệ enzyme/cơ chất.
- Ứng dụng enzyme thu ñược ñể xây dựng quy trình thu nhận chitosan
oligosaccharide.

2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Chitosan
Chitosan có công thức phân tử là (C6H11NO4
)
n
. Về cấu trúc, chitosan là dẫn
xuất deacetyl hoá của chitin, trong ñó nhóm (–NH
2) thay thế nhóm (-NHCOCH
3
) ở
vị trí C(2). Chitosan ñược cấu tạo từ các mắt xích D-glucosamine liên kết với nhau
bởi các liên kết β-(1-4)-glycoside, do vậy chitosan có thể gọi là poly β-(1-4)-2-amino-2-deoxy-D-glucose hoặc là poly β-(1-4)-D- glucosamine [59].
Poly (1, 4-2-amino-2-deoxy-ß-D-glucosamine)
Hình 2.1 Cấu trúc hoá học của chitosan
Hiện nay, chitosan ñược sản xuất từ vỏ tôm bằng cả 2 phương pháp hoá
học và sinh học. Trong phương pháp hóa học, deacetyl hóa chitin bằng kiềm
với các ñiều kiện phản ứng khác nhau như nồng ñộ kiềm, thời gian phản ứng
mà cho chitosan có các mức ñộ deacetyl khác nhau. Trong phương pháp sinh
học có thể dùng enzyme deacetylase ñể khử acetyl của chitin tạo thành
chitosan. Ngoài ra có thể kết hợp các enzyme khác trong quy trình hoá học ñể
tăng hiệu quả sản xuất, giảm ô nhiễm môi trường và tận thu các sản phẩm
khác. Các enzyme này thường là protease như papain, bromelain, và các
enzyme từ ñộng vật, thực vật, vi sinh vật có tác dụng khử protein trong
nguyên liệu ban ñầu, còn deacetylase chủ yếu thu nhận từ việc nuôi cấy các vi
sinh vật thường tồn tại nhiều trên vỏ tôm, ñặc biệtở những nơi vỏ tôm ñang
phân huỷ.
2.2. Enzyme chitosanase
2.2.1. Khối lượng phân tử
Chitosanase cũng giống như ñại bộ phận enzyme khác ñều có bản chất là
protein. Chitosanase hầu hết là enzyme ngoại bào, có cấu tạo ñơn phân tử.
Chúng có khối lượng phân tử khoảng từ 30 – 50kDa. Kích thước phân tử protein
của enzyme chitosanase sản sinh từ các nguồn khác nhau thì khác nhau. Người
ta ñã tiến hành thí nghiệm và tính toán khối lượng phân tử của protein
chitosanase thu ñược từ một số loài vi sinh vật khác nhau (bảng 2.1).
Bảng 2.1 Khối lượng phân tử của một số enzyme chitosanase





TÀI LIỆU THAM KHẢO
I. TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. A.J. Borderías, I. Sánchez – Alonso, M. Pérez – Mateos (2005). Những
ứng dụng mới của chất xơ trong thực phẩm-chất bổ sung vào sản phẩm
hải sản (Cao Minh Hậu dịch). Tạp chí Khoa học – Công nghệ Thuỷ sản số
2/2006, tr. 89 – 93.
2. Phạm Thị Trân Châu, Phan Tuấn Nghĩa (2007), Công nghệ sinh học,
NXB Giáo dục.
3. Trần Thái Hòa (2005), “Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình
deacetyl hóa và cắt mạch chitin ñể ñiều chế glucosamine”.Tạp chí khoa
học, ðại học Huế,47.
4. Nguyễn Văn Mùi (2001). Thực hành hoá sinh học, NXB Khoa học và kỹ
thuật, Hà Nội.
5. Vũ Công Phong (2007). Những ñặc ñiểm của Chitin, Chitosan và dẫn xuất.
6. Phạm Hồng Ngọc Thúy, “Bước ñầu nghiên cứu thu nhận chế phẩm
enzyme chitosanase kỹ thuật từ Streptomyces griceus”, Tạp chí Khoa học
– Công nghệ Thủy sản – số 03/2008.
7. ðặng Thị Thu, Lê Ngọc Tú, Tô Kim Anh, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Xuân
Sâm, 2005. Công nghệ enzyme, NXB khoa học và kỹ thuật.
II. TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI
8. H.Barreteauetal.(2006),”Oligosaccharidesas Food Additives”. Food
Technol. Biotechnol, 44 (3), 323–333.
9. Y. J. Choi, E. J. Kim, Z. Piao (2004). “Purification and Characterization
of Chitosanase from Bacillus sp. Strain KCTC 0377BP and Its
Application for the Production of Chitosan Oligosaccharides”. Applied
and environmental microbiology, 70 (8), 4522–4531.
10. Choi, B., Kim, K., Yoo, Y., Oh, S., Choi, J., Kim, C., 2001, In vitro
antimicrobial activity of a chitooligosaccharides mixture against
Actinobacillus actinomycetemcomitans and Streptococcus mutans,
International Journal of Antimicrobial Agents, 18, 553-557.
11. Xiao-E Chen, Xu-Bo Fang and Wen-Sui Xia (2008), “Strain
improvement and optimization of the mediacomposition of chitosanaseproducing fungus Aspergillus sp.CJ 22-326”. African Journal of
Biotechnology,7 (14), 2501-2508.
12. T. Fukamizo, Brzezinski (2000). The chitosanase from Streptomyces
sp. N174 Biochemical properties and recombinant production system.
13. T. Fukamizo, R. Brzezinski (1997). “Chitosanase from Streptomycessp.
strain N174: a comparative review of its structure and function”. Biochem.
Cell Biol. 75(6), p. 687–696.
14. T. Fukamizo, R. Brzezinski (1997).“Chitosanase from Streptomycessp.
strain N174: a comparative review of its structure and function”. Biochem.
Cell Biol. 75(6), p. 687–696.
15. Gama Sosa, M.A., Fazely, F., Koch, J.A., Vercellotti, S.V., Ruprecht,
R.M., 1991, N-carboxymethyl chitosan-N, O-sulfate as an anti-HIV-1
agent, Biochemical and Biophysical Research Communication, 174, 489-496.
16. Horowitz, S. T., Roseman, S., Blumenthal, H. J., 1957, The preparation
of glucosamine oligosaccharides, Separation, Journal of the American
Chemical Society, 79,5046-5049.
17. Y.Y. Jo, K.J. Jo, Y.L. Jin, J.H. Jim, Y.W. Kim, and R.Y. Park (2003), “
Characterization and Kinetics of 45 kDa chitosanase from Bacillus sp.
P16”. Biosci. Biotechnol. Biochem.,67 (9), 1875-1882.