Thạc Sĩ Thu nhận dextrin, maltose, α-glucose từ tinh bột

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
Chuyên ngành: Hoá sinh
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - 2011

MỤC LỤC ( Luận văn dài 127 trang có File WORD)



CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU . 1

1.1 MỞ ĐẦU . 2
1.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN VĂN 4
1.2.1. Nghiên cứu thu nhận gen mã hóa cellulase bằng phương pháp metagenomics từ đất 4
1.2.2. Nghiên cứu thu nhận gen mã hóa cellulase từ các chủng xạ khuẩn có hoạt tính cellulase phân lập từ Vườn quốc gia Nam Cát Tiên 5
1.2.3. Nghiên cứu thu nhận các gen mã hóa cellulase từ vi khuẩn C. Thermocellum 5

CHƯƠNG 2: TỒNG QUAN TÀI LIỆU 7

2.1. CELLULASE 8
2.1.1. Cellulose . 8
2.1.2. Phân loại cellulase 8
2.1.3. Các nhóm vi sinh vật có cellulase trong tự nhiên . 12
2.2. METAGENOMICS . 13
2.2.1 Metagenome và metagenomics 13

2.4.3. Các nghiên cứu về gen và enzym cellulase từ C. thermocellum . 25
2.4.4. Các cellulase từ C. thermocellum được nghiên cứu trong luận văn 26

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 28

3.1 VẬT LIỆU . 29
3.1.1 Dụng cụ và thiết bị . 29
3.1.2. Hóa chất . 29
3.1.3. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật 36
3.1.4. Vật liệu sinh học 39
3.2. PHƯƠNG PHÁP . 42
3.2.1. Thu nhận metagenome DNA từ đất 42
3.2.2. Nhân bản đoạn gen mã hóa cellulase từ metagenome DNA bằng phảnứng PCR . 43
3.2.3. Xây dựng thư viện metagenome DNA 50
3.2.4. Sàng lọc dòng có hoạt tính cellulase từ thư viện metagenome DNA . 52
3.2.5. Sàng lọc các chủng xạ khuẩn có khả năng phân hủy cơ chất CMC 53
3.2.6. Ly trích genome DNA các chủng xạ khuẩn có hoạt tính thủy phân CMC
3.2.7. Thu nhận đoạn gen mã hóa cellulase từ xạ khuẩn có hoạt tính thủy phân

4.1. THU NHẬN GEN MÃ HÓA CELLULASE BẰNG PHƯƠNG PHÁP METAGENOMICS
4.1.1. Thu nhận metagenome DNA . 67
4.1.2. Nhân bản gen mã hóa cellulase bằng phản ứng PCR dựa vào các cặp mồi thoái hóa được thiết kế từ vùng bảo tồn trình tự axit amin 68
4.1.3. Nhân bản gen mã hóa cellulase bằng phản ứng PCR dựa vào các cặp mồi
được thiết kế từ vùng bảo tồn trình tự nucleotide 69
4.1.4. Xây dựng thư viện metagenome với pBluescript II SK (+) và plasmid pMBD14 trong tế bào chủ E. coli
4.2. NGHIÊN CỨU THU NHẬN GEN MÃ HÓA CELLULASE TỪ CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN CÓ HOẠT TÍNH CELLULASE PHÂN LẬP TỪ VƯỜN QUỐC GIA NAM CÁT TIÊN 79
4.2.1. Sàng lọc các chủng xạ khuẩn có hoạt tính thủy phân CMC 79
4.2.2. Thu nhận đoạn gen mã hóa cellulase từ xạ khuẩn có hoạt tính thủy phân
CMC bằng phản ứng PCR 80
4.3. TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN CÁC GEN MÃ HÓA CELLULASE TỪ VI KHUẨN CLOSTRIDIUM THERMOCELLUM
4.3.1. Thu nhận các gen mã hóa cellulase celA, celS của vi khuẩn Clostridium


CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN . 101
Tài liệu tham khảo . 105


DANH MỤC BẢNG BIỂU, SƠ ĐỒ

BẢNG
Bảng 1.1. Bảng so sánh giá trị bổ dưỡng giữa gạo lức và bắp hạt . 14
Bảng 1.2. Tiêu chuẩn chất lượng của maltose tinh thể 21
Bảng 2.1: Các bước tiến hành xây dựng đường chuẩn glucose . 29
Bảng 2.2: Các bước tiến hành xây dựng đường chuẩn maltose . 32
Bảng 2.3: Mối tương quan giữa nồng độ tinh bột và giá trị DOD
(phương pháp Heinkel) 33
Bảng 2.4: Tiến hành phản ứng thủy phân tinh bột bởi enzyme . 33
Bảng 2.5. Các bước tiến hành xác định hoạt độ enzyme GA của dung dịch mẫu
Bảng 3.1. Hoạt độ chung của enzyme Termamyl-LS 42
Bảng 3.2. Hoạt độ chung của enzyme Sebamyl-L . 42
Bảng 3.3. Hoạt độ chung của enzyme AMG-E 43
Bảng 3.4. Thành phần sinh hóa chủ yếu của bột bắp . 43
Bảng 3.5. Thành phần sinh hóa chủ yếu của bột gạo . 44
Bảng 3.6. Thành phần sinh hóa chủ yếu của bột năng . 44
Bảng 3.7. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian thủy phân
bằng acid HCl trên cơ chất bột gạo, tương ứng với chỉ số DE 45
Bảng 3.8. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian thủy phân
bằng acid HCl trên cơ chất bột bắp, tương ứng với chỉ số DE 46
Bảng 3.9. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian thủy phân
bằng acid HCl trên cơ chất bột năng, tương ứng với chỉ số DE 47
Bảng 3.10. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian thủy phân
bằng acid HCl trên cơ chất tinh bột tan tương ứng với chỉ số DE . 48
Bảng 3.11. So sánh lượng đường khử tạo thành khi thủy phân tinh bột bằng
tác nhân acid HCl trên các nguồn cơ chất khác nhau 50
Bảng 3.12. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian thủy
phân bằng enzyme Termamyl trên cơ chất bột gạo và giá trị DE 51

Bảng 3.13. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian thủy
phân bằng enzyme Termamyl trên cơ chất bột bắp và giá trị DE 52
Bảng 3.14. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian thủy
phân bằng enzyme Termamyl trên cơ chất bột năng và giá trị DE 53
Bảng 3.15. Lượng dextrin thu được . 54
Bảng 3.16. So sánh lượng đường khử tạo ra trong quá trình dịch hóa
bằng enzyme Termamyl trên các nguồn cơ chất khác nhau 56
Bảng 3.17. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian
thủy phân bằng enzyme Sebamyl-L trên bột gạo và giá trị DE . 57
Bảng 3.18. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian
thủy phân bằng enzyme Sebamyl-L trên bột bắp và giá trị DE . 58
Bảng 3.19. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian
thủy phân bằng enzyme Sebamyl-L trên bột năng và giá trị DE . 59
Bảng 3.20. Lượng maltose thu được 60
Bảng 3.21. So sánh lượng đường khử tạo thành trong quá trình dịch hóa
bằng enzyme Sebamyl trên các nguồn cơ chất khác nhau . 61
Bảng 3.22. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian
thủy phân bằng enzyme AMG-E trên bột gạo và giá trị DE 62
Bảng 3.23. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian
thủy phân bằng enzyme AMG-E trên bột bắp và giá trị DE 63
Bảng 3.24. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian
thủy phân bằng enzyme AMG-E trên bột năng và giá trị DE 64
Bảng 3.25. So sánh lượng đường khử tạo thành trong quá trình
dịch hóa bằng enzyme AMG-E trên các nguồn cơ chất khác nhau . 65
Bảng 3.26. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian thủy phân bằng enzyme Sebamyl sau khi dịch hóa bằng acid HCl trên bột gạo và giá trị DE 66
Bảng 3.27. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian thủy phân bằng enzyme Sebamyl sau khi dịch hóa bằng acid HCl trên bột bắp và giá trị DE . 67
Bảng 3.28. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian thủy phân bằng enzyme Sebamyl sau khi dịch hóa bằng acid HCl trên bột năng và giá trị DE . 68
Bảng 3.29. So sánh lượng đường khử tạo ra trong quá trình dịch hóa bằng acid và đường hóa bằng enzyme Sebamyl trên các nguồn cơ chất khác nhau 69
Bảng 3.30. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian thủy phân bằng enzyme AMG-E sau khi dịch hóa bằng acid HCl trên bột gạo và giá trị DE . 70
Bảng 3.31. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian thủy phân bằng enzyme AMG-E sau khi dịch hóa bằng acid HCl trên bột bắp và giá trị DE . 71
Bảng 3.32. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian thủy phân bằng enzyme AMG-E sau khi dịch hóa bằng acid HCltrên bột năng và giá trị DE . 72
Bảng 3.33. So sánh lượng đường khử tạo thành trong quá trình dịch hóa bằng acid và đường hóa bằng enzyme AMG trên
các nguồn cơ chất khác nhau 73

SƠ ĐỒ
Sơ đồ 1.1. Quy trình sản xuất dextrin . 18
Sơ đồ 2.1. Sơ đồ sản xuất dịch xirô glucose xirô maltose bằng enzyme amylase . 40
Sơ đồ 2.2. Sơ đồ sản xuất dịch xirô glucose xirô maltose bằng
phương pháp kết hợp axit và enzyme amylase. . 41



DANH MỤC HÌNH, ĐỒ THỊ

HÌNH

Hình 1.1. Các enzyme thủy phân tinh bột . 4
Hình 1.2. Cấu trúc của amylose và amylopectin . 11
Hình 1.3. Cấu tạo Maltose . 19
Hình 1.4. Công thức cấu tạo glucose (dạng mạch hở và 2 dạng mạch
vòng α-glucose, β-glucose) 21
Hình 1.5. Máy HPLC . 24
Hình 1.6. Mô hình hệ thống HPLC điển hình 24
Hình 3.1. Dung dịch thu được: trước (trái) và sau (phải) khi ly tâm và xử lý bằng than hoạt tính. (Tương ứng ống 1: bột bắp,ống 2: bột gạo, ống 3: bột năng) 74


BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1. So sánh lượng đường khử tạo thành khi thủy phân tinh bột
bằng tác nhân acid HCl trên các nguồn cơ chất khác nhau 50
Biểu đồ 3.2. So sánh lượng đường khử tạo ra trong quá trình dịch hóa
bằng enzyme Termamyl trên các nguồn cơ chất khác nhau 56
Biểu đồ 3.3. So sánh lượng đường khử tạo thành trong quá trình
đường hóa bằng enzyme Sebamyl trên các nguồn cơ chất khác nhau . 61
Biểu đồ 3.4. So sánh lượng đường khử tạo thành trong quá trình
đường hóa bằng enzyme AMG-E trên các nguồn cơ chất khác nhau 65
Biểu đồ 3.5. So sánh lượng đường khử tạo ra trong quá trình dịch hóa bằng acid và đường hóa bằng enzyme Sebamyl trên các nguồncơ chất khác nhau . 70
Biểu đồ 3.6. So sánh lượng đường khử tạo thành trong quá trình dịch hóa bằng acid và đường hóa bằng enzyme AMG trên các nguồn cơ chất khác nhau 74

ĐỒ THỊ Trang

Đồ thị 3.1. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian
thủy phân bằng acid HCl trên bột gạo và giá trị DE 46
Đồ thị 3.2. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian
thủy phân bằng acid HCl trên bột bắp và giá trị DE 47
Đồ thị 3.3. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian
thủy phân bằng acid HCl trên bột năng và giá trị DE 48
Đồ thị 3.4. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian
thủy phân bằng acid HCl trên tinh bột tan và giá trị DE 49
Đồ thị 3.5. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời
gian thủy phân bằng enzyme Termamyl trên bột gạo và giá trị DE 52
Đồ thị 3.6. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian
thủy phân bằng enzyme Termamyl trên bột bắp và giá trị DE 53
Đồ thị 3.7. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian
thủy phân bằng enzyme Termamyl trên bột năng và giá trị DE 54
Đồ thị 3.8. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian
thủy phân bằng enzyme Sebamyl trên bột gạo và giá trị DE . 57
Đồ thị 3.9. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian
thủy phân bằng enzyme Sebamyl trên bột bắp và giá trị DE . 58
Đồ thị 3.10. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian
thủy phân bằng enzyme Sebamyl trên bột năng và giá trị DE . 59
Đồ thị 3.11. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian
thủy phân bằng enzyme AMG-E trên bột gạo và giá trị DE 62
Đồ thị 3.12. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian
thủy phân bằng enzyme AMG-E bột bắp và giá trị DE . 63
Đồ thị 3.13. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian

thủy phân bằng enzyme AMG-E bột năng và giá trị DE . 64
Đồ thị 3.14. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian thủy phân bằng enzyme Sebamyl sau khi dịch hóa bằng acid HCl trên bột gạo và giá trị DE . 67
Đồ thị 3.15. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian thủy phân bằng enzyme Sebamyl sau khi dịch hóa bằng acid HCl trên bột bắp và giá trị DE . 68
Đồ thị 3.16. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian thủy phân bằng enzyme Sebamyl sau khi dịch hóa bằng acid HCl trên bột năng và giá trị DE . 69
Đồ thị 3.17. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian thủy phân bằng enzyme AMG-E sau khi dịch hóa bằng acid HCl trên bột gạo và giá trị DE . 71
Đồ thị 3.18. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian thủy phân bằng enzyme AMG-E sau khi dịch hóa bằng acid HCl trên bột bắp và giá trị DE . 72
Đồ thị 3.19. Sự biến đổi lượng đường khử tạo thành theo thời gian thủy phân bằng enzyme AMG-E sau khi dịch hóa bằng acid HCl trên bột năng và giá trị DE . 73



Phần 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan về sự thủy phân tinh bột [1, 2, 6]

Tinh bột có nhiều ứng dụng thiết thực và rộng rãi trong sản xuất của các ngành công nghiệp, nhất là công nghiệp thực phẩm. Tuy nhiên các đặc tính của tinh bột không phải lúc nào cũng phù h ợp trong các quy trình chế biến; rất nhiều sản phẩm thu được từ quá trình chuyển hóa tinh bột đem lại hiệu quả kinh tế cao, như dextrin, maltose, dung dịch xi rô nồng độ glucose cao (high glucose syrup), dung dịch xi rô nồng độ frutose cao (HFS - high frutose syrup), tinh bột biến tính, và các sản phẩm sau chuyển hóa này được sử dụng rất hữu ích trong y dược, có tác dụng tốt trong chăm sóc sức khỏe cộng đồng như sản phẩm chuyển hóa từ tinh bột có tác dụng prebiotic: IMO (IsoMaltose Oligosaccharide).
Vì những lí do trên, việc biến đổi các đặc tính tinh bột để cải thiện chức năng của tinh bột và thu các sản phẩm có giá trị là một việc hết sức cần thiết. Công nghệ biến đổi tinh bột thông thường được thực hiện bằng phương pháp hóa học và phương pháp sinh học, thông qua phản ứng cắt, oxy hóa hay chuyển gốc hóa học nhằm thu các sản phẩm có giá trị theo ý muốn.
1.1.1. Sự thủy phân tinh bột bằng phương pháp hóa học [2]

Dưới tác động của các tác nhân hóa học, tinh bột bị thay đổi tính chất. Dựa trên bản chất những biến đổi xảy ra trong phân tử tinh bột, Kovalxkaia (1994) phân chia tinh bột bị biến tính bằng hóa chất thành hai loại: tinh bột cắt và tinh bột bị thay thế.
Nhóm tinh bột cắt thường có độ nhớt thấp, mạch tinh bột bị cắt bằng tác nhân acid, hay chất oxy hóa, hay một vài loại muối, Kết quả là trong phân tử tinh bột xảy ra hiện tượng đứt gãy các liên kết glucoside và các liên kết khác, giảm trọng lượng, xuất hiện một số liên kết mới trong và giữa các phân tử. Cấu trúc hạt của tinh bột có thể bị phá vỡ ít nhiều, tuy nhiên về căn bản chúng vẫn được giữ nguyên. Một sản phẩm quan trọng của nhóm tinh bột cắt là tinh bột tan dùng trong phòng thí nghiệm. Trong công nghiệp thực phẩm, tinh bột loại này dùng để tạo cấu trúc gel trong khi sản xuất bánh kẹo. [2]
Dưới tác động của tác nhân oxy hóa như KMnO4 trong môi trường acid, tinh bột bị oxy hóa được sử dụng thay thế agar, pectin trong sản xuất bánh kẹo, kem, các sản phẩm sữa và đồ hộp. Các sản phẩm bị oxy hóa yếu được dùng trong sản xuất bánh mì để cải thiện tính chất cơ học, tăng khả năng giữ khí của bột nhào, giảm thời gian lên men, và tăng chất lượng bánh.
Trong trường hợp khác, tinh bột được xử lý ẩm, hạt tinh bột trương nở trong nước khi có mặt các chất hóa học như muối của H3PO4, methylcellulose làm phá hủy một phần hay hoàn toàn cấu trúc của hạt. Tinh bột loại này được sử dụng như chất giữ ẩm trong sản xuất kẹo, kem, bánh pudding, các loại mì sợi, bánh mì và nhiều loại thức ăn kiêng. Trong trường hợp được xử lý ở độ ẩm cao, tinh bột sẽ bị mất gần như hoàn toàn tính chất và cấu trúc ban đầu, tạo ra dạng tinh bột – protein mới dùng trong công nghiệp thực phẩm để sản xuất các sản phẩm từ thịt, cá
Tinh bột thay thế là nhóm tinh bột mà tính chất của chúng thay đổi do các nhóm hydroxyl ở cacbon 2, 3 và 6 liên kết với các gốc hóa học hay do co-polymer hóa với một hợp chất cao phân tử khác, hoặc hai mạch polysaccharide có thể bị gắn vào nhau do các liên kết dạng cầu nối. [1, 2]
Mức độ biến tính tinh bột được đặc trưng bởi độ thế (Degree of Substitution – DS). DS là số nhóm hyđroxyl bị thế trên một AGU (Anhydrous Glucose Unit). Như vậy, độ thế có giá trị trong khoảng 0-3. Ví dụ các gốc rượu ở carbon thứ 2, 3, 6 của tinh bột dạng này tham gia vào phản ứng với các hợp chất vô cơ hoặc hữu cơ, như acid H3PO4 và muối phosphate, để tạo tinh bột phosphate. Trong trường hợp này, tính chất tinh bột bị thay đổi rõ rệt kể cả khi lượng chất hóa học sử dụng rất ít. Thông thường loại tinh bột này (còn gọi là đi-tinh bột) có độ nhớt và độ bền kết dính cao, kể cả trong điều kiện đông lạnh. Chúng được sử dụng để sản xuất các sản phẩm cần bảo quản lạnh như kem, majoner, các loại nước xốt và sản phẩm dành cho trẻ em.