Thạc Sĩ Thiết kế vector và bước đầu biểu hiện protein tiểu đơn vị B độc tố không chịu nhiệt LT của ETEC trên

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 11
Chương 1: TỔNG QUAN . 13
1.1. Tình hình vệ sinh an toàn thực phẩm . 13
1.1.1. Trên thế giới . 13
1.1.2. Ở Việt Nam 14
1.2. Ngộ độc thực phẩm do Escherichia coli 15
1.2.1. Vài nét về E.coli 15
1.2.2. Phân loại . 17
1.2.3. Đặc điểm sinh học 18
1.2.4. Khả năng gây bệnh ở đường tiêu hóa . 19
1.3. Ngộ độc thực phẩm do ETEC . 23
1.3.1. Trên thế giới . 23
1.3.2. Việt Nam 23
1.3.3. Bệnh cảnh lâm sàng và dịch tễ học của ngộ độc thực phẩm do ETEC . 24
1.4. Các phương pháp xác định E.coli . 25
1.4.1. Phương pháp định danh kinh điển 25
1.4.2. Thử nghiệm tạo váng và gây ngưng kết hồng cầu . 26
1.4.3. Phương pháp thử nghiệm trên động vật thực nghiệm 26
1.4.4. Phương pháp miễn dịch học . 27
1.4.5. Phương pháp nuôi cấy trên tế bào 30
1.4.6. Kỹ thuật sinh học phân tử 31
1.4.7. Kỹ thuật sắc ký miễn dịch: . 36

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. . 37
2.1. Đối tượng nghiên cứu . 37
2.1.1. Chủng vi khuẩn và plasmid 37
2.1.2. Hóa chất, máy móc và thiết bị 37
2.1.3. Môi trường và đệm . 39
2.1.4. Cặp mồi sử dụng . 40
2.2. Phương pháp nghiên cứu 41
2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu 41
2.2.2. Các phương pháp tiến hành nghiên cứu . 41

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU . 53
3.1. Khuyếch đại đoạn gen biến nạp EltB bằng kỹ thuật PCR 53
3.2. Nuôi cấy và tinh sạch plasmid pGEX và cắt bằng enzym giới hạn . 53
3.3. Cắt đoạn gen EltB bằng các enzym giới hạn. . 54
3.4. Nối đoạn gen EltB vào vector pGEX 55
3.4.1. Kiểm tra đoạn gen biến nạp bằng kỹ thuật PCR 55
3.4.2. Kiểm tra đoạn gen biến nạp bằng kỹ thuật cắt enzym giới hạn . 56
3.4.3. Kiểm tra đoạn gen biến nạp bằng giải trình tự gen 56
3.5. Biểu hiện protein tái tổ hợp EltB 58
3.5.1. Biến nạp plasmid pGEX-EltB vào tế bào biểu hiện protein E.coli BL21 58
3.5.2. Biểu hiện protein tái tổ hợp EltB 59
3.5.3. Kiểm tra protein EltB bằng Western blot 60

Chương 4: BÀN LUẬN . . 61
4.1. Khuyếch đại đoạn gen biến nạp EltB bằng kỹ thuật PCR 61
4.1.1. Thiết kế mồi 61
4.1.2. Tách chiết DNA khuôn mẫu từ chủng ETEC . 62
4.1.3. Thực hiện phản ứng PCR . 62
4.2. Nuôi cấy và tinh sạch plasmid pGEX . 62
4.2.1. Lựa chọn vector tách dòng . 62
4.2.2. Biến nạp đoạn gen EltB vào vector pGEX 63
4.3. Biểu hiện Protein tái tổ hợp EltB 64
4.3.1. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E.coli khả biến bằng sốc nhiệt 64
4.3.2. Kiểm tra sự biểu hiện của protein tái tổ hợp EltB 66
4.4. Kiểm tra mức độ biểu hiện protein EltB bằng Western blot 66
KẾT LUẬN 68
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


ĐẶT VẤN ĐỀ
Chất lượng an toàn vệ sinh thực phẩm (ATVSTP) có liên quan trực tiếp hàng ngày, thường xuyên, liên tục đến sức khỏe con người, ảnh hưởng lâu dài đến nòi giống. Sử dụng thực phẩm không đảm bảo chất lượng, vệ sinh sẽ dẫn đến các nguy cơ cao gây ngộ độc thực phẩm cấp tính và mạn tính. Không những thế, nó còn ảnh hưởng đến sự phát triển kinh tế, xã hội, an ninh chính trị và quan hệ quốc
tế [13]. Theo thống kê của Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa bệnh tật Mỹ thì hàng năm trên thế giới có khoảng 1,3 tỷ người tiêu chảy trong đó có 70% nguyên nhân do sử dụng thực phẩm không an toàn [28]. Tại các nước đang phát triển, mỗi năm có khoảng 1/3 dân số bị các bệnh do thực phẩm gây ra, trong đó bệnh tiêu chảy là thường gặp nhất và gây tử vong khoảng 2,2 triệu người [23].
Ở Việt Nam ngộ độc thực phẩm là một vấn đề đang được quan tâm hàng đầu, theo ước tính của bộ Y tế, chỉ riêng năm 2001 đã có 4,2 triệu người bị ngộ độc thực phẩm. Từ năm 2001-2006, cả nước ghi nhận được hơn 560.0000 ca tiêu chảy do ngộ độc thực phẩm, trong đó có 84 ca tử vong. Riêng trong 9 tháng đầu năm 2010 đã ghi nhận được hơn 750.000 ca tiêu chảy và 12 ca tử vong liên quan đến thực phẩm. Tuy nhiên theo các chuyên gia thì số liệu thựcphải gấp ít nhất 10 lần con số được công bố [6, 16].
Các bệnh liên quan đến thực phẩm hiện nay vẫn là một mối nguy cơ chính tác động đến sức khỏe con người trên thế giới [50]. Trong đó, vi khuẩn E.coli sinh độc tố (Enterotoxigenic- ETEC) là một trong những nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy quan trọng cho trẻ em ở các quốc gia đang phát triển và cho khách du lịch đến những vùng có dịch lưu hành. Thực phẩm và nước bị ô nhiễm là những phương tiện lây truyền chủ yếu của loại vi khuẩn này. Các mẫu xét nghiệm thực phẩm và nước thường có tỷ lệ ô nhiễm cao với ETEC ở vùng có dịch lưu hành [25,43]. Nhiễm trùng do ETEC thường xảy ra vào những mùa nóng, ẩm ướt sẽ là những điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn phát triển trong thực phẩm và nước. ETEC có khả năng sinh độc tố chịu nhiệt (heat stable toxin-ST) và độc tố không chịu nhiệt (heat labile toxin-LT). Độc tố không chịu nhiêt có cấu trúc và chức năng như độc tố tả (cholera toxin). Vì vậy người bị nhiễm độc tố này sẽ bị tiêu chảy cấp tính với mức độ mất nước trầm trọng. Trên thế giới nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu và sản xuất thành công protein tái tổ hợp tiểu đơn vị B của độc tố LT của ETEC và sử dụng protein tái tổ hợp này để thiết kế các bộ sinh phẩm chẩn đoán ETEC gây
bệnh bằng kỹ thuật ELISA và latex thu được kết quả tốt [29, 34]. Nguyên lý của kỹ thuật là sử dụng protein tái tổ hợp tiểu đơn vị B của độc tố LT gây miễn dịch tạo kháng thể kháng LT, sau đó sử dụng kháng thể này để phát hiện độc tố LT của ETEC.
Với điều kiện khí hậu nóng ẩm ở Việt Nam và sự thiếu hiểu biết về vệ sinh an toàn thực phẩm của người dân nên ngộ độc thực phẩm do E. Coli sinh độc tố chiếm tỷ lệ không nhỏ. Phương pháp nuôi cấy không thể phát hiện được ETEC trong thực phẩm. Bởi vậy, việc sử dụng kỹ thuật PCR nhằm phát hiện các gen mã hóa độc tố của các chủng ETEC trong thực phẩm đang được quan tâm [29, 34, 38].
Một nghiên cứu ở Việt Nam của Nguyễn Thị Thanh Yến và cộng sự năm 2005 tại viện Dinh dưỡng về ứng dụng kỹ thuật ELISA phát hiện khả năng sinh độc tố LT của ETEC trong các mẫu thực phẩm đã được công bố [21]. Tuy nhiên kỹ thuật này giá thành cao và phức tạp cho nên rất khó áp dụng cho các phòng xét nghiệm thực phẩm ở tuyến cơ sở. Xuất phát từ thực tiễn đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Thiết kế vector và bước đầu biểu hiện protein tiểu đơn vị B độc tố không chịu nhiệt LT của ETEC trên vi khuẩn E.coli”. Đây là bước quan trọng cho nghiên cứu tiếp theo để sản xuất bộ que thử nhanh nhằm chẩn đoán độc tố không chịu nhiệt (LT) của
ETEC ở trên một số nhóm thực phẩm. Mục tiêu nghiên cứu:
1. Thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa cho kháng nguyên tái tổ hợp EltB.
2. Biểu hiện và tinh sạch Protein EltB trong tế bào vi khuẩn E.coli BL21.