Tài liệu Thiết kế vector và bước đầu biểu hiện protein tiểu đơn vị B độc tố không chịu nhiệt LT của ETEC trên

ĐỀ TÀI: Thiết kế vector và bước đầu biểu hiện protein tiểu đơn vị B độc tố không chịu nhiệt LT của ETEC trên vi khuẩn E.coli

ĐẶT VẤN ĐỀ

Chất l­ượng ATVSTP có liên quan trực tiếp hàng ngày, thường xuyên, liên tục đến sức khỏe con người, ảnh hưởng lâu dài đến ṇi giống dân tộc. Sử dụng thực phẩm không đảm bảo chất lượng, vệ sinh sẽ dẫn đến ngộ độc cấp tính, ngộ độc mạn tính, các bệnh truyền qua thực phẩm. Chất độc tính lũy trong cơ thể gây ảnh hưởng đến sức khỏe lâu dài, giảm khả năng lao động, gây các bệnh mạn tính, rối loạn chuyển hóa và có thể gây ung thư. Không những thế, nó c̣n ảnh hưởng đến sự phát triển kinh tế, xă hội, an ninh chính trị và quan hệ quốc tế [13]. Theo thống kê của Trung tâm kiểm soát và pḥng ngừa bệnh tật Mỹ th́ hàng năm trên thế giới có khoảng 1,3 tỷ người tiêu chảy trong đó có 70% nguyên nhân do sử dụng thực phẩm không an toàn [26]. Tại các nước đang phát triển, mỗi năm có khoảng 1/3 dân số bị các bệnh do thực phẩm gây ra, trong đó bệnh tiêu chảy là thường gặp nhất và gây tử vong khoảng 2,2 triệu người [22].
Ở Việt Nam ngộ độc thực phẩm là một vấn đề đang được quan tâm hàng đầu, theo ước tính của bộ Y tế, chỉ riêng năm 2001 đó cú 4,2 triệu người bị ngộ độc thực phẩm. Từ năm 2001-2006, cả nước ghi nhận được hơn 5600000 ca tiêu chảy do ngộ độc thực phẩm, trong đó có 84 ca tử vong. Riêng trong 9 tháng đầu năm ngoái ghi nhận được hơn 750.000 ca tiêu chảy trong đó có 12 ca tử vong. Thực tế theo các chuyên gia phải gấp ít nhất 10 lần con số được công bố [10].[20].
Các bệnh liên quan đến thực phẩm hiện nay vẫn là một mối nguy cơ chính tác động đến sức khoẻ con người trên thế giới (Wood và CS 1983). Trong đó, vi khuẩn E.coli sinh độc tố (ETEC) là một trong những nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy quan trọng cho trẻ em ở các quốc gia đang phát triển và cho khách du lịch đến những vựng cú dịch lưu hành. Thực phẩm và nước bị ô nhiễm là những phương tiện lây truyền chủ yếu của loại vi khuẩn này. Các mẫu xét nghiệm thực phẩm và nước thường có tỷ lệ ô nhiễm cao với ETEC ở vựng cú dịch lưu hành (Black và CS, 1981,1982; Ryder và CS, 1976). Nhiễm trùng do ETEC thường xảy ra vào những mùa nóng, ẩm ướt sẽ là những điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn phát triển trong thực phẩm và nước. ETEC có khả năng sinh độc tố chịu nhiệt ST và độc tố không chịu nhiệt LT. Độc tố không chịu nhiờt cú cấu trúc và chức năng như độc tố tả (cholerae toxin). V́ vậy người bị nhiễm độc tố này sẽ bị tiêu chảy cấp tính với mức độ mất nước trầm trọng. Trên thế giới nhiều nhà khoa học đó nhiờn cứu và sản xuất thành công protein tái tổ hợp tiểu đơn vị B của độc tố LT của ETEC và sử dụng protein tái tổ hợp này để thiết kế các bộ sinh phẩm chẩn đoán các ETEC gây bệnh bằng kỹ thuật ELSA và latex đă thu được kết quả tốt (Cryan B,1990; Oto và CS,1983). Nguyên lư của kỹ thuật là sử dụng protein tái tổ hợp tiểu đơn vị B của độc tố LT gây miễn dịch tạo ra kháng thể kháng LT sau đó sử dụng kháng thể này để phát hiện độc tố LT của ETEC.
Với điều kiện khí hậu nóng ẩm ở Việt Nam và sự thiếu hiểu biết về vệ sinh an toàn thực phẩm của người dân nên ngộ độc thực phẩm do E. Coli sinh độc tố (ETEC) chiếm tỷ lệ không nhỏ. Phương pháp nuôi cấy không thể phát hiện được ETEC trong thực phẩm mà phải phát hiện được sự có mặt của độc tố ETEC trong thực phẩm bằng kỹ thuật PCR nhằm phát hiện các gen mă hóa độc tố của các chủng ETEC trong thực phẩm. (Cryan B, 1990; Ito và CS,1983; Nguyễn Vũ Trung và CS, 2005).
Cho đến nay có một nghiên cứu ở Việt Nam của tác giả Nguyễn Thị Thanh Yến và CS năn 2005 tại viện dinh dưỡng về ứng dụng kỹ thuật ELISA để phát hiện khả năng sinh độc tố LT của ETEC trong các mẫu thực phẩm. Tuy nhiên các kỹ thuật này giá thành c̣n cao và phức tạp cho nên rất khó áp dụng cho các phong xét nghiệm thực phẩm ở tuyến cơ sở. Xuất phát từ thực tiễn đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Thiết kế vector và bước đầu biểu hiện protein tiểu đơn vị B độc tố không chịu nhiệt LT của ETEC trên vi khuẩn E.coli ” . Đây là bước quan trọng cho nghiên cứu tiếp theo nhằm mục đích sản xuất bộ sinh phẩm chẩn đoán độc tố không chịu nhiệt (LT) của ETEC ở trên một số nhóm thực phẩm
Mục tiêu nghiên cứu:
1. Thiết kế vector biểu hiện gen mă hóa cho kháng nguyên tái tổ hợp EltB
2. Biểu hiện và tinh sạch Protein EltB trong tế bào vi khuẩn E.coli BL21

















Chương 1
TỔNG QUAN

1.1.Tỡnh h́nh vệ sinh an toàn thực phẩm
1.1.1.Trên thế giới
Theo thống kê của Trung tâm kiểm soát và pḥng ngừa bệnh tật Mỹ th́ hàng năm trên thế giới có khoảng 1,3 tỷ người tiêu chảy trong đó có 70% nguyên nhân do sử dụng thực phẩm không an toàn [26]. Tại các nước đang phát triển, mỗi năm có khoảng 1/3 dân số bị các bệnh do thực phẩm gây ra, trong đó bệnh tiêu chảy là thường gặp nhất và gây tử vong khoảng 2,2 triệu người [22].
Tại Úc, mỗi ngày có khoảng 11.500 người bị ngộ độc thực phẩm. Ở Mỹ hàng năm ước đoán có khoảng 5 đến 6 triệu người bị mắc bệnh do nguyên nhân ăn uống và hơn 9000 trường hợp tử vong [12].[48].
Một nghiên cứu khác về bệnh từ thực phẩm bị ô nhiễm VSV gây bệnh ở New-York Mỹ, phát hiện có sự gia tăng gấp 4 lần từ 1980 đến 1990. [6].
Ở Trung Quốc năm 1998 có 292.000 người bị ngộ độc thực phẩm do virus viêm gan A làm tử vong 9 người. Năm 1999 xảy ra 591 vụ ngộ độc thực phẩm với 17.971 người mắc, chết 108 người. Nguyên nhân chính là do thực phẩm bị ô nhiễm VSV là 8.505 trường hợp, do hóa chất là 9.506 trường hợp, thực vật hặc động vật có chất độc là 2.719 trường hợp. Phần lớn các trường hợp ngộ độc xảy tại các căng tin là 7.529 trường hợp[2]. Một thống kê trong 10 năm xác định các yếu tố nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm tại Trung Quốc cho thấy 93,24 % là nguyên nhân vi sinh vật, chỉ có 6,76% bởi các yếu tố hóa học [23].
Ngộ độc thực phẩm do VSV ngày càng gia tăng ở các quốc gia đang phát triển và ở cả các quốc gia đă phát triển, đăc biệt là E.coli. Ở Nhật Bản năm 1996 có khoảng 800 người bị nhễm bệnh do Enterohaemorrhagie E.coli [3].
1.1.2. Ở Việt Nam.
T́nh trạng ô nhiễm thực phẩm đang diễn ra khá phổ biến trên cả nước, chủ yếu là ô nhiễm mầm bệnh sinh học và hóa chất [10]. Tại Hà Nội, tỷ lệ thức ăn đường phố ô nhiễm vi khuẩn cao (46,7%) [10]. Điều tra tại thành phố Hồ Chí Minh cho thấy, 100% các mẫu thực phẩm được kiểm tra: bánh ḿ, thịt nguội, thịt quay và dưa muối không đảm bảo vệ sinh thực phẩm về mặt vi sinh [3]. Tại Hải Pḥng có 76,4% thực phẩm không đạt tiêu chuẩn vệ sinh, trong đó tỷ lệ không đạt vệ sinh của thức ăn đường phố là 92,9%. Có tới 85% mẫu thực phẩm ăn ngay tại các chợ không đạt tiêu chuẩn về vi sinh, với số lượng vi khuẩn có trong thực phẩm vượt mức cho phép nhiều lần, kể cả các vi khuẩn gây bệnh nguy hiểm [20]. Không chỉ ở các thành phố lớn, t́nh trạng nhiễm vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm c̣n diễn ra phổ biến ở rất nhiều địa phương khác trên cả nước [10].
Cùng với t́nh trạng ô nhiễm thực phẩm, ngộ độc thực phẩm ở Việt Nam xảy ra cũng rất thường xuyên. Theo thống kê chưa đầy đủ của Cục ATVSTP, từ năm 2000 đến năm 2007, trung b́nh mỗi năm có khoảng 181 vụ ngộ độc thực phẩm xảy ra với khoảng 5.211 người mắc và khoảng 48 ca tử vong. Tỷ lệ mắc ngộ độc thực phẩm trung b́nh là 6,05/100.000 dân, tỷ lệ chết là 0,06/100.000 dân/năm. Tuy nhiên, trên thực tế, do ch­ưa có hệ thống giám sát đến cơ sở, việc thống kê báo cáo c̣n ch­ưa đ­ược thiết lập nên số ca ngộ độc thực phẩm thực tế hàng năm c̣n cao hơn rất nhiều. Theo ­ước tính của WHO, ngộ độc thực phẩm hàng năm ở Việt Nam khoảng trên 8 triệu ca. Ngoài t́nh trạng ngộ độc thực phẩm cấp tính, ngộ độc thực phẩm mạn tính cũng đang diễn ra khá phức tạp. Ngộ độc thực phẩm mạn tính thường Ưt được chú v́ biểu hiện lâm sàng thường không dữ dội như ngộ độc cấp tính. Tuy nhiên, hậu quả của ngộ độc thực phẩm mạn tính c̣n nguy hiểm hơn nhiều, dẫn đến biết bao hệ lụy cho sức khỏe cộng đồng.
Riêng trong quư IV năm 2010, cả nước xảy ra 18 vụ ngộ độc làm 4 người tử vong, trong đó có 3 vụ ngộ độc lớn từ 30 người trở lên. Số người bị ngộ độc là 323 người với 242 người nhập viện.
Nguyên nhân chính là do vi sinh (gồm 4 nhóm vi khuẩn chính là Salmonella, Streptoccocus, E.Coli và Staphylococcus); do độc tố tự nhiên và hóa chất. Có 5/18 vụ ngộ độc không xác định được nguyên nhân do không lấy được mẫu thực phẩm lưu tại cơ sở.
Mới đây nhất, ngày 30/12, có 461 công nhân thuộc 4 công ty trên địa bàn quận 12 và huyện Húc Mụn, TP.HCM đă lần lượt phải nhập viện cấp cứu v́ ngộ độc thực phẩm (Dinh dưỡng .com.vn)
1.2.Ngộ độc thực phẩm do E.coli
1.2.1. Vài nét về E.coli
E.coli do Eschirich phân lập từ phân người năm 1885
E.coli kư sinh b́nh thường trong đại tràng người và một số động vật. Sau khi trẻ ra đời khoảng 3h, người ta đă thấy E.coli trong đại tràng và từ đó nó sống suốt đời với cơ thể vật chủ
E.coli góp phần tiêu hóa thức ăn, phân giải muối mật, sản xuất một số sinh tố, giữ thăng bằng vi khuẩn chí ở ruột. Trong số vi khuẩn hiếu khí ở đại tràng, E.coli chiếm 80%






Một số h́nh ảnh của E.coli


H́nh 1. H́nh ảnh E.coli trên kính hiển vi điện tử


H́nh 2: khuẩn lạc E.coli trên môi trường thạch Endo
1.2.2 Phân loại
Có nhiều cách phân chia loài E.coli nhưng cách phân loại theo type huyết thanh là hay được dùng hơn cả. Cách phân loại này dựa trên cấu trúc kháng nguyên khác nhau cú trờn bề mặt tế bào vi khuẩn.
- Kháng nguyên O là quyết định kháng nguyên quan trọng nhất. Bản chất là lipopolisaccharide nằm trờn vỏch tế bào vi khuẩn. Có 171 loại kháng nguyên O đă được xác định, một số trong số chỳng cú phản ứng chéo với các vi khuẩn khác [34].[44].
- Kháng nguyên K là kháng nguyên bề mặt. Kháng nguyên K nằm bên ngoài kháng nguyên O. Người ta đă xác định được khoảng 80 loại kháng nguyên K khác nhau [14].[34].
- Kháng nguyên H là kháng nguyên lụng cú bản chất hóa học là protein. Có 56 loại kháng nguyên lông khác nhau [14].[34].
Dựa trên các kháng nguyên O, K và H người ta đă phân biệt được trên 700 type huyết thanh khác nhau của E.coli
Phân loại dựa vào sự ly giải bởi phage đặc hiệu có khoảng 50 type phage
Phân loại dựa vào tính chất gây bệnh chia làm 5 loại [21].
- EPEC (Enteropathogenic E.coli): E.coli gây bệnh đường ruột
- EHEC ( Enterohemorrhagic E.coli): E.coli gây chảy máu đường ruột
- ETEC (Enterotoxigenic E.coli): E.coli sinh độc tố ruột
- EIEC (Enteroinvasive E.coli): E.coli xâm nhập đường ruột
- EAEC Enteroadherent E.coli) E.coli bỏm dính đường ruột
1.2.3. Đặc điểm sinh học
1.2.3.1. H́nh thái học
- E.coli là trực khuẩn kích thước trung b́nh 1-3àx 0,5àm, đứng riêng rẽ hoặc đôi khi thành đôi. Trong những điều kiện không thích hợp (ví dụ: trong môi trường có kháng sinh), vi khuẩn có thể dài như sợi chỉ.
- Bắt mầu Gram (-)
- Di động bằng hệ thống lông xung quanh thân hoặc không di động.
- Có thể có vỏ.