ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh cúm là một trong những bệnh nhiễm trùng đường hô hấp phổ biến nhất, hàng năm trên thế giới có khoảng 10% đến 20% dân số nhiễm bệnh cúm [42], trong đó có 3 đến 5 triệu trường hợp bị bệnh nặng và 300.000 – 500.000 trường hợp tử vong [31]. Tác nhân gây bệnh cúm là virus cúm (Influenza virus), gồm 4 type A, B, C và Thogovirus (đôi khi còn gọi là type D). Trong đó type A quan trọng nhất, và được nghiên cứu nhiều. Virus cúm A được chia thành nhiều thứ type (subtype), dựa trên hai kháng nguyên protein bề mặt là Hemagglutinin (HA) và Neuraminidase (NA). Năm 1996, chủng virus H5N1 (một thứ type của virus cúm A) châu Á đầu tiên được phân lập trên ngỗng Quảng Đông, Trung Quốc. Đến năm 1997, lần đầu chủng H5N1 vượt hàng rào vật chủ lây nhiễm sang người làm 6 người thiệt mạng trong số 18 bệnh nhân ở HongKong [71]. Riêng ở Việt Nam, từ cuối tháng 12 năm 2003, dịch cúm H5N1 ban đầu xuất hiện ở một số tỉnh phía Bắc, sau đó lan rộng ra toàn quốc, gây nhiều thiệt hại nặng nề [2]. Từ đó đến nay, tổng cộng đến ngày 15/05/2009 theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), Việt Nam có 111 trường hợp dương tính với H5N1, trong đó có 56 trường hợp tử vong. Gene NA là một trong hai gene quan trọng nhất trong tổng số 8 gene của virus cúm A. Gene NA mã hóa cho kháng nguyên protein bề mặt Neuraminidase virus cúm, và được chia thành 9 thứ type (N1-N9). Neuraminidase có hình nấm, hoạt động như một enzyme, chúng thúc đẩy sự giải phóng các hạt virus mới sinh ra khỏi tế bào chủ, bằng cách loại bỏ các axít sialic trên protein HA và NA mới được tổng hợp [15, 58]. Nếu không có NA, các hạt virus không giải phóng được và kết lại thành khối trên bề mặt tế bào chủ. Dựa vào tính chất này, các nhà khoa học đã tạo ra những chất ức chế hoạt tính Neuraminidase như Zanamivir [Relenza], Oseltamivir [Tamiflu], . có tác dụng ngăn cản quá trình phóng thích các hạt virus mới sinh ra. Từ đó virus không thể nhiễm sang các tế bào vật chủ mới, vì vậy làm cho virus ngừng lan rộng trong đường hô hấp [42]. Mặc dù Oseltamivir hiệu quả hơn nhiều so với vaccine trong việc phòng chống bệnh cúm, song trong một số x trường hợp gene N1 đột biến ở những vị trí quan trọng, cũng khiến cho virus kháng lại chất ức chế này, như đột biến His274 (Histidine ở vị trí 274) [69], hoặc Asn294 (Asparagine ở vị trí 294) [75], Điều này cho thấy gene N1 đóng vai trò quan trọng trong độc tính của virus cúm A. Vì vậy việc khảo sát dịch tễ học phân tử cũng như ứng dụng kỹ thuật di truyền ngược để nghiên cứu gene N1 của các chủng H5N1 Việt Nam là rất quan trọng và cần phải triển khai. Nhờ đó sẽ bổ sung thêm các thông tin di truyền về gene N1 của các chủng H5N1 đang lưu hành tại Việt Nam. Kỹ thuật di truyền ngược (reverse genetics system) là thuật ngữ chỉ cho quá trình tái tạo ra các hạt virus hoàn chỉnh từ các cDNA của virus đó đã dòng hóa (clone) vào các plasmid chuyên dụng. Việc ứng dụng thành công kỹ thuật di truyền ngược để tạo virus cúm A năm 1989 đã tạo ra một cuộc cách mạng về nghiên cứu virus cúm, vì nó cho phép con người có thể đưa bất kỳ đột biến mong muốn nào vào trong bộ gene của virus cúm A [18, 38]. Đây là một công cụ rất hữu ích cho phép chúng ta có thể thao tác trên bộ gene của virus mà không bị hạn chế về mặt kỹ thuật, và hiểu sâu xa hơn về chu trình sống của virus, sự tương tác giữa virus và tế bào vật chủ trong đáp ứng miễn dịch, sự điều hoà chức năng của protein virus và cơ chế phân tử về khả năng gây bệnh của virus. Hệ thống này còn được sử dụng để tạo virus cúm A giảm độc lực phục vụ cho việc nghiên cứu và sản xuất vaccine [28, 46]. Ở Việt Nam, kỹ thuật di truyền ngược là một công cụ nghiên cứu còn khá mới mẻ, và hiện tại cũng chỉ có một số ít các phòng thí nghiệm bước đầu nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật này trên virus cúm A, labo Sinh học Phân tử Viện Pasteur Tp. HCM là một trong số các phòng thí nghiệm ấy. Các nhà khoa học đã nghiên cứu, thiết lập và cải tiến nhiều về kỹ thuật di truyền ngược, và hiện tại cũng đã có nhiều hệ thống khác nhau phục vụ cho việc tạo virus cúm A. Trong đề tài này, chúng tôi ứng dụng kỹ thuật di truyền ngược để tạo ra virus cúm A tái tổ hợp giảm độc lực mang bảy gene của chủng A/PR/8/34 (H1N1) với một gene N1 của chủng A/DK/Viet Nam/7B-TV/2008 (H5N1) lưu hành tại Việt Nam, nhằm phục vụ cho những nghiên cứu sâu hơn về đặc tính sinh học của gene này cũng như tiềm năng tạo ra các chủng virus thích hợp cho việc phát triển vaccine về lâu dài. Mục tiêu của đề tài Tạo ra các plasmid chứa cDNA gene N1 của các chủng virus gia cầm H5N1 tại một số khu vực phía nam Việt Nam. Giải trình tự gene N1 của các chủng virus gia cầm H5N1 lưu hành tại một số khu vực phía nam trong khoảng thời gian từ năm 2006 đến 2008, phân tích những đột biến (nếu có). Ứng dụng kỹ thuật di truyền ngược (Reverse Genetics system) để tạo virus cúm A H1N1 tái tổ hợp giảm độc lực hoàn toàn từ các plasmid, và mang gene NA của chủng A/DK/Viet Nam/7B-TV/2008 (H5N1) lưu hành tại Việt Nam năm 2008. Thời gian và địa điểm nghiên cứu - Thời gian nghiên cứu: Đề tài được thực hiện từ tháng 9/2007 đến tháng 3/2009. - Địa điểm nghiên cứu: Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử, Viện Pasteur, Thành phố Hồ Chí Minh. MỤC LỤC Trang phụ bìa Trang Mục Lục . i Danh mục các chữ viết tắt iv Danh mục các bảng vii Danh mục các hình . vii Đặt vấn đề ix 1. Tổng quan tài liệu 2 1.1 Tình hình dịch tễ virus cúm A . 2 1.2 Đại cương về virus cúm A . 5 1.2.1 Phân loại và cách đọc tên 5 1.2.2 Đặc điểm sinh thái virus cúm A 6 1.2.3 Hình thái - cấu trúc hạt virus cúm A . 6 1.2.4 Đặc điểm vật chất di truyền và chức năng 7 1.2.5 Kháng nguyên Neuraminidase (NA) . 11 1.2.5.1 Đặc điểm cấu trúc và chức năng 11 1.2.5.2 Các đột biến quan trọng trên NA . 15 1.2.6 Chu trình sinh sản của virus cúm trong tế bào chủ 16 1.2.6.1 Bám dính, xâm nhập và tháo vỏ của virus ở tế bào chủ 16 1.2.6.2 Sinh tổng hợp mRNA và sao chép RNA của virus . 17 1.2.6.3 Quá trình đóng gói và nẩy chồi 18 1.2.7 Đặc điểm di truyền của virus cúm A . 20 1.2.7.1 Đột biến thường xuyên (Antigenic Drift) 20 1.2.7.2 Tái sắp xếp vật liệu di truyền (Antigenic Shift) 21 1.3 Kỹ thuật di truyền ngược cho virus cúm A . 22 1.3.1 Khái niệm về kỹ thuật di truyền ngược . 22 1.3.2 Sử dụng kỹ thuật di truyền ngược để tạo virus cúm A 22 ii 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 29 2.1 Vật liệu 29 2.1.1 Hóa chất . 29 2.1.2 Các bộ Kit sử dụng 30 2.1.3 Các plasmid . 30 2.1.4 Các dòng tế bào và chủng E.coli . 31 2.1.5 Các thiết bị . 31 2.1.6 Các vật liệu khác 32 2.2 Phương pháp 33 2.2.1 Biến nạp các plasmid vào tế bào khả nạp TOP10 . 33 2.2.1.1 Nối DNA mục tiêu vào vector . 33 2.2.1.2 Biến nạp các plasmid vào tế bào E.coli khả nạp TOP10 . 33 2.2.1.3 Phân tích kết quả biến nạp . 33 2.2.1.4 Tách plasmid mục tiêu từ tế bào TOP10 . 34 2.2.1.5 Cắt plasmid mục tiêu bằng enzyme cắt giới hạn . 35 2.2.2 Định lượng plasmid DNA . 35 2.2.3 Chuyển nhiễm các plasmid vào hỗn hợp tế bào 36 2.2.4 Phương pháp chuẩn độ virus TCID50 37 2.2.5 Phản ứng ngưng kết hồng cầu (Hemagglutination test) 37 2.2.5.1 Chuẩn bị hồng cầu gà . 38 2.2.5.2 Phản ứng ngưng kết 38 2.2.6 Reverse Transcriptase - Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) 39 2.2.6.1 Tách RNA virus . 39 2.2.6.2 Tổng hợp cDNA 40 2.2.6.3 PCR với các cặp primers đặc hiệu . 40 2.2.6.4 Điện di 40 2.2.7 Phương pháp giải trình tự DNA 41 2.2.7.1 Tinh sạch sản phẩm DNA cần giải trình tự . 42 2.2.7.2 PCR đánh dấu sản phẩm DNA cần giải trình tự 42 2.2.7.3 Xử lý mẫu DNA và nạp mẫu vào máy CEQTM 8000 42 iii 3. Kết quả và bàn luận 44 3.1 Dòng hóa các gene N1 vào vector plasmid PCR®2.1 . 44 3.1.1 Thu nhận gene N1 từ RNA bệnh phẩm . 44 3.1.2 Biến nạp các plasmid PCR®2.1 chứa gene N1 vào tế bào TOP10 45 3.2 Giải trình tự gene N1 của các chủng H5N1 47 3.3 Tạo virus cúm A bằng kỹ thuật di truyền ngược . 56 3.3.1 Biến nạp plasmid pHW2000 chứa gene N1 vào tế bào TOP10 56 3.3.2 Tách plasmid bằng Kit Midi và định lượng plasmid . 60 3.3.3 Chuyển nhiễm các plasmid vào hỗn hợp tế bào 61 3.3.4 Reverse Transcriptase - Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) 65 3.3.5 Giải trình tự gene N1 . 65 4. Kết luận và đề nghị . 68 4.1. Kết luận 68 4.2. Đề nghị . 69 Các công trình đã công bố . 70 Tài liệu tham khảo . 71 Phụ lục . 76
