Luận Văn Tạo virus cúm a tái tổ hợp mang gene na của chủng h5n1 việt nam bằng kỹ thuật di truyền ngược

MAI VAN NAM


MỤC LỤC
Trang phụ bìa Trang
Mục Lục . i
Danh mục các chữ viết tắt . .iv
Danh mục các bảng vii
Danh mục các hình . vii
Đặt vấn đề ix
1. Tổng quan tài liệu 2
1.1 Tình hình dịch tễ virus cúm A . 2
1.2 Đại cương về virus cúm A . 5
1.2.1 Phân loại và cách đọc tên 5
1.2.2 Đặc điểm sinh thái virus cúm A 6
1.2.3 Hình thái - cấu trúc hạt virus cúm A . 6
1.2.4 Đặc điểm vật chất di truyền và chức năng 7
1.2.5 Kháng nguyên Neuraminidase (NA) . 11
1.2.5.1 Đặc điểm cấu trúc và chức năng . . 11
1.2.5.2 Các đột biến quan trọng trên NA . 15
1.2.6 Chu trình sinh sản của virus cúm trong tế bào chủ 16
1.2.6.1 Bám dính, xâm nhập và tháo vỏ của virus ở tế bào chủ 16
1.2.6.2 Sinh tổng hợp mRNA và sao chép RNA của virus . 17
1.2.6.3 Quá trình đóng gói và nẩy chồi 18
1.2.7 Đặc điểm di truyền của virus cúm A . 20
1.2.7.1 Đột biến thường xuyên (Antigenic Drift) 20
1.2.7.2 Tái sắp xếp vật liệu di truyền (Antigenic Shift) 21
1.3 Kỹ thuật di truyền ngược cho virus cúm A . 22
1.3.1 Khái niệm về kỹ thuật di truyền ngược . 22
1.3.2 Sử dụng kỹ thuật di truyền ngược để tạo virus cúm A 22
ii
2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 29
2.1 Vật liệu 29
2.1.1 Hóa chất . 29
2.1.2 Các bộ Kit sử dụng 30
2.1.3 Các plasmid . 30
2.1.4 Các dòng tế bào và chủng E.coli . 31
2.1.5 Các thiết bị . 31
2.1.6 Các vật liệu khác . . 32
2.2 Phương pháp . . 33
2.2.1 Biến nạp các plasmid vào tế bào khả nạp TOP10 . 33
2.2.1.1 Nối DNA mục tiêu vào vector . 33
2.2.1.2 Biến nạp các plasmid vào tế bào E.coli khả nạp TOP10 . 33
2.2.1.3 Phân tích kết quả biến nạp . 33
2.2.1.4 Tách plasmid mục tiêu từ tế bào TOP10 . 34
2.2.1.5 Cắt plasmid mục tiêu bằng enzyme cắt giới hạn . 35
2.2.2 Định lượng plasmid DNA . 35
2.2.3 Chuyển nhiễm các plasmid vào hỗn hợp tế bào 36
2.2.4 Phương pháp chuẩn độ virus TCID50 37
2.2.5 Phản ứng ngưng kết hồng cầu (Hemagglutination test) 37
2.2.5.1 Chuẩn bị hồng cầu gà . 38
2.2.5.2 Phản ứng ngưng kết 38
2.2.6 Reverse Transcriptase - Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) 39
2.2.6.1 Tách RNA virus . 39
2.2.6.2 Tổng hợp cDNA 40
2.2.6.3 PCR với các cặp primers đặc hiệu . 40
2.2.6.4 Điện di 40
2.2.7 Phương pháp giải trình tự DNA 41
2.2.7.1 Tinh sạch sản phẩm DNA cần giải trình tự . 42
2.2.7.2 PCR đánh dấu sản phẩm DNA cần giải trình tự 42
2.2.7.3 Xử lý mẫu DNA và nạp mẫu vào máy CEQTM 8000 42
iii
3. Kết quả và bàn luận 44
3.1 Dòng hóa các gene N1 vào vector plasmid PCR®2.1 . 44
3.1.1 Thu nhận gene N1 từ RNA bệnh phẩm . 44
3.1.2 Biến nạp các plasmid PCR®2.1 chứa gene N1 vào tế bào TOP10 45
3.2 Giải trình tự gene N1 của các chủng H5N1 47
3.3 Tạo virus cúm A bằng kỹ thuật di truyền ngược . 56
3.3.1 Biến nạp plasmid pHW2000 chứa gene N1 vào tế bào TOP10 56
3.3.2 Tách plasmid bằng Kit Midi và định lượng plasmid . 60
3.3.3 Chuyển nhiễm các plasmid vào hỗn hợp tế bào 61
3.3.4 Reverse Transcriptase - Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) 65
3.3.5 Giải trình tự gene N1 . 65
4. Kết luận và đề nghị . 68
4.1. Kết luận 68
4.2. Đề nghị . 69
Các công trình đã công bố . 70
Tài liệu tham khảo . 71
Phụ lục . 76