Thạc Sĩ Tạo va2 tinh sạch kháng thể thỏ đặc hiệu Fcγ người cộng hợp fitc

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Chuyên ngành: Sinh Học Thực Nghiệm
NĂM 2010

MỤC LỤC

1. ĐẶT VẤN ĐỀ . 1
2. TỔNG QUAN VỀ SINH HỌC CỦA KHÁNG THỂ 2
2.1. Lịch sử về sự phát hiện ra kháng thể . .. . .. . .. . .. .. . .. . .. .. . .. .. 2
2.1.1. “Viên đạn thần” và miễn nhiễm dịch thể 2
2.1.2. Kỹ thuật điện di cho biết kháng thể là protein globulin γ . 4
2.1.3. Xác định cấu trúc phân tử kháng thể 7
2.1.3.1. Cấu trúc ba chiều và tổ chức thành vùng của phân tử IgG . 10
2.1.3.2. Cấu trúc không gian của biểu vị 15
2.1.3.3. Tính đặc hiệu và ái lực giữa cận vị và biểu vị 16
2.1.3.4. Các loại KT trong cơ thể . 19
2.2. Sự phát triển của các tế bào bạch huyết B .. .. .. . .. . .. . .. . .. .. . .... 20
2.2.1. Các tế bào bạch huyết B . 21
2.2.2. Các vật liệu di truyền của KT và hoạt động của chúng 22
2.2.2.1. Các gen chuỗi nặng và chuỗi nhẹ 22
2.2.2.2. Cơ chế tổ chức, sắp xếp gen của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ 24
2.2.3. KN đặc hiệu hoạt hóa và sự nhân dòng 29
2.2.4. Tế bào B có hoạt động thực bào và sự hỗ trợ của tế bào T . 34
2.3. Kháng thể đa dòng . .. . .. . .. . .. .. . .. . .. .. . .. . .. . .. . .. .. . .... 38
2.3.1. Ái lực của KT đối với KN và hằng số cân bằng . 39
2.3.2. Tạo kháng thể đa dòng theo lý thuyết và thực tế . 40
2.3.3. Kháng thể đa dòng trong nghiên cứu sinh học và ứng dụng chẩn
đoán . 47
3. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP . 49
3.1. Vật liệu . .. . .. .. . .. . .. . .. . .. .. . .. . .. .. . .. . .. . .. .. . .. . .... 49
3.1.1. Động vật thí nghiệm và huyết thanh . 49
3.1.2. Hóa chất . 49
3.1.3. Trang thiết bị . 55

3.2. Phương pháp . . .. .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. . .. .... 56
3.2.1. Tinh sạch IgGngười từ huyết thanh . 56
3.2.2. Tạo kháng nguyên Fcγ người . 57
3.2.3. Tạo kháng huyết thanh trên thỏ 60
3.2.4. Tạo cột sắc ký ái lực gắn IgG người và Fcγ người 64
3.2.5. Tinh chế kháng thể thỏ đặc hiệu Fcγngười 65
3.2.6. Cộng hợp kháng thể thỏ với FITC 66
3.2.7. Phương pháp xét nghiệm kháng thể kháng nhân – ANA (antinuclear antibody) 68

4. KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN 72
4.1. Nguyên liệu . .. . .. .. . .. . .. .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. . .. .. . .... 72
4.1.1. Thu hồi IgGngười từ huyết thanh . 72
4.1.2. Tinh sạch Fcγngười 74
4.2. Tạo kháng huyết thanh thỏ . .. . .. .. . .. . .. .. . .. . .. . .. .. . .. . .... 77
4.2.1. Kiểm tra đáp ứng mẫn cảm . 77
4.2.2. Thu kháng huyết thanh thỏ 79
4.3. Sắc ký ái lực để tinh chế IgG thỏ đặc hiệu với Fcγngười .. . .. . .. .. . .... 79
4.3.1. Sắc ký ái lực Sepharose–Fcγngười 79
4.3.2. Sắc ký ái lực Sepharose – IgGngười . 80
4.3.3. Điện di kiểm tra độ tinh sạch của KT thỏ sau khi qua hai cột SKAL81
4.4. Cộng hợp IgGthỏ đặc hiệu với Fcγngười với FITC .. .. . .. . .. . .. .. . .... 82
4.4.1. Tỉ lệ cộng hợp FITC vào IgGthỏ . 82
4.4.2. Kết quả sử dụng FITC– IgG khángFcg và khả năng chẩn đoán 84

5. KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 85
5.1. Kết luận .. . .. . .. .. . .. . .. .. . .. . .. . .. . .. .. . .. . .. . .. .. . .... 86
5.2. Đề nghị . .. . .. .. . .. . .. . .. . .. .. . .. . .. .. . .. . .. . .. .. . .. . .. 86


DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 3.1: Thành phần gel SDSưPAGE 52
Bảng 3.2: Tương tác giữa các phân tử Ig người (thỏ) đối với protein A 58
Bảng 3.3: Quy trình gây miễn nhiễm trên một con thỏ . 62
Bảng 4.1: Thu hồi IgG từ huyết thanh người lành 72
Bảng 4.2: Kết quả thu hồi protein sau khi qua SKL Sephacryl S200 HR 73
Bảng 4.3: Lượng Fcγ người thu hồi 75
Bảng 4.4: Hàm lượng protein thu được sau khi cột sắc ký Sepharose – Fcγngười 79
Bảng 4.5: Hàm lượng protein thu được sau khi cột sắc ký Sepharose – IgGngười . 80
Bảng 4.6: Sản phẩm cộng hợp FITC . 83
Bảng 4.7: Kết quả xét nghiệm ANA của thuốc thử DAKO 84
Bảng 4.8: Kết quả xét nghiệm ANA bằng “KT của công trình nghiên cứu” 85

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 2.1: Hình Paul Ehrlich & Hata Sahachiro 2
Hình 2.2: Miêu tả thuyết “các nhóm hóa chất” của Erhlich 4
Hình 2.3: Hình ảnh điện di huyết thanh của người bình thường và bệnh nhân u. 5
Hình 2.4: “Viên đạn thần” của công nghệ nano ứng dụng trong ngành dược 6
Hình 2.5: Cấu trúc của IgG của thỏ cho thấy sự sắp xếp khá phức tạp của những liên kết ưSưSư ở trong và giữa chuỗi nặng hoặc chuỗi nhẹ Hình 2.6 : Cấu trúc bậc bốn của phân tử immunoglobulin . 12
Hình 2.7: Vùng siêu biến động (HRVs) của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ . 13
Hình 2.8: Các loại lực liên kết giữa KT – KN . 15

Hình 2.9: Những công trình dùng tia X để xác định cấu trúc chi tiết tinh thể phức
hợp cận vị - biểu vị của KT kháng lysozyme . 17
Hình 2.10: Tổ chức các gen lambda và kappa người 23
Hình 2.11: Tái sắp xếp, phiên mã, chế biến lại RNA, dịch mã của gen kappa . 25
Hình 2.12: Minh họa tổ chức gen của chuỗi nặng . 25
Hình 2.13: Mô hình miêu tả quá trình tái sắp xếp DNA, quá trình phiên mã chuỗi 28
Hình 2.14: Phiên mã chuỗi nặng H . 29
Hình 2.15: Hình thái tế bào B 30
Hình 2.16: Siêu biến đổi thể của tế bào B tại hạch ngoại vi . 33
Hình 2.17: Tế bào T hỗ trợ hoạt hóa tế bào B . 35
Hình 2.18: Tế bào APC trình diện KN cho tế bào T giúp phát triển sự miễn nhiễm để thích nghi 37
Hình 2.19: APC (tế bào trình diện kháng nguyên) nhận biết MTB (vi khuẩn lao) . 41
Hình 2.20: Các TLR và phối tử của chúng 43
Hình 2.21: Dụng cụ tạo huyền dịch . 46
Hình 3.1: Phản ứng hóa học giữa protein và thạch CNBr hoạt hóa 64
Hình 3.2: Cấu trúc phân tử FITC . 67
Hình 3.3: Nguyên lý miễn dịch huỳnh quang . 69
Hình 3.4: Tấm kính sử dụng cho hóa mô miễn dịch . 70
Hình 4.1: Sắc ký đồ Sephacryl S200 HR 73
Hình 4.2: Kết quả điện di SDS-PAGE 12% IgGngười . 74
Hình 4.3: Kết quả điện di tinh chế Fcγ người trên gel SDS – PAGE 12% 76

Hình 4.4 : Đáp ứng với KN Fcγ người của HT thỏ sau mẫn cảm 78
Hình 4.5: Kiểm tra hiệu giá của huyết thanh thỏ đối với Fcγ người sau đáp ứng mẫn cảm . 78
Hình 4.6: Điện di KTthỏ (qua SKAL) . 82


1. ĐẶT VẤN ĐỀ

Phương pháp tạo nên kháng thể (KT) đặc hiệu với một cấu trúc mong muốn ngày càng trở nên phổ biến để có thuốc cho các xét nghiệm hoặc điều trị.

Tại phòng xét nghiệm tại Bệnh viện Đại học Y Dược tp. HCM, đòi hỏi phải có KT súc vật đặc hiệu với KT người (IgGngười) để xác định sự có mặt của KT kháng nhân (antinuclear antibody - ANA) ở huyết thanh bệnh nhân tự miễn. KT súc vật thường sử dụng là thương phẩm mua từ nước ngoài với giá thành cao, hơn nữa không chủ động về nguồn cung cấp. Ngoài ra, nhu cầu KT súc vật đặc hiệu với IgGngười thực tế rất lớn vì để xét nghiệm các bệnh nhiễm khuẩn khác.
Trong lúc đó, huyết thanh người đã được xét nghiệm là âm tính đối với các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm (HIV, HBV, HCV) hằng ngày thường được loại bỏ. Trên thực tế thuận lợi về mặt nguyên vật liệu này, chúng tôi muốn từ nguyên liệu sẵn có để chế tạo Fcγngười sử dụng như là KN, dùng để gây miễn dịch cho thỏ để có kháng huyết thanh đặc hiệu với IgGngười làm thuốc thử để thay thế hàng ngoại nhập.

Khi có kháng huyết thanh thỏ, IgG thỏ được tinh chế và tạo cộng hợp IgG – FITC (flourecein isothicyanate) làm thuốc thử huỳnh quang đặc hiệu với KT người.