Thạc Sĩ Tạo và tinh sạch kháng thể thỏ đặc hiệu fcy người cộng hợp fitc

ĐẶT VẤN ĐỀ
Phương pháp tạo nên kháng thể (KT) đặc hiệu với một cấu trúc mong muốn ngày càng trở nên phổ biến để có thuốc cho các xét nghiệm hoặc điều trị. Tại phòng xét nghiệm tại Bệnh viện Đại học Y Dược tp. HCM, đòi hỏi phải có KT súc vật đặc hiệu với KT người (IgGngười) để xác định sự có mặt của KT kháng nhân (antinuclear antibody - ANA) ở huyết thanh bệnh nhân tự miễn. KT súc vật thường sử dụng là thương phẩm mua từ nước ngoài với giá thành cao, hơn nữa không chủ động về nguồn cung cấp. Ngoài ra, nhu cầu KT súc vật đặc hiệu với IgG người thực tế rất lớn vì để xét nghiệm các bệnh nhiễm khuẩn khác. Trong lúc đó, huyết thanh người đã được xét nghiệm là âm tính đối với các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm (HIV, HBV, HCV) hằng ngày thường được loại bỏ. Trên thực tế thuận lợi về mặt nguyên vật liệu này, chúng tôi muốn từ nguyên liệu sẵn có để chế tạo Fcγ người sử dụng như là KN, dùng để gây miễn dịch cho thỏ để có kháng huyết thanh đặc hiệu với IgGngười làm thuốc thử để thay thế hàng ngoại nhập.
Khi có kháng huyết thanh thỏ, IgG thỏ được tinh chế và tạo cộng hợp IgG – FITC (flourecein isothicyanate) làm thuốc thử huỳnh quang đặc hiệu với KT người.
MỤC LỤC

1. ĐẶT VẤN ĐỀ . 1
2. TỔNG QUAN VỀ SINH HỌC CỦA KHÁNG THỂ 2
2.1. Lịch sử về sự phát hiện ra kháng thể . 2
2.1.1. “Viên đạn thần” và miễn nhiễm dịch thể 2
2.1.2. Kỹ thuật điện di cho biết kháng thể là protein globulin γ . 4
2.1.3. Xác định cấu trúc phân tử kháng thể 7
2.1.3.1. Cấu trúc ba chiều và tổ chức thành vùng của phân tử IgG . 10
2.1.3.2. Cấu trúc không gian của biểu vị 15
2.1.3.3. Tính đặc hiệu và ái lực giữa cận vị và biểu vị 16
2.1.3.4. Các loại KT trong cơ thể . 19
2.2. Sự phát triển của các tế bào bạch huyết B . 20
2.2.1. Các tế bào bạch huyết B . 21
2.2.2. Các vật liệu di truyền của KT và hoạt động của chúng 22
2.2.2.1. Các gen chuỗi nặng và chuỗi nhẹ 22
2.2.2.2. Cơ chế tổ chức, sắp xếp gen của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ 24
2.2.3. KN đặc hiệu hoạt hóa và sự nhân dòng 29
2.2.4. Tế bào B có hoạt động thực bào và sự hỗ trợ của tế bào T . 34
2.3. Kháng thể đa dòng . 38
2.3.1. Ái lực của KT đối với KN và hằng số cân bằng . 39
2.3.2. Tạo kháng thể đa dòng theo lý thuyết và thực tế . 40
2.3.3. Kháng thể đa dòng trong nghiên cứu sinh học và ứng dụng chẩn đoán . 47
3. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP . 49
3.1. Vật liệu . 49
3.1.1. Động vật thí nghiệm và huyết thanh . 49
3.1.2. Hóa chất . 49
3.1.3. Trang thiết bị . 55
3.2. Phương pháp 56
3.2.1. Tinh sạch IgGngười từ huyết thanh . 56
3.2.2. Tạo kháng nguyên Fcγ người . 57
3.2.3. Tạo kháng huyết thanh trên thỏ 60
3.2.4. Tạo cột sắc ký ái lực gắn IgG người và Fcγ người 64
3.2.5. Tinh chế kháng thể thỏ đặc hiệu Fcγngười 65
3.2.6. Cộng hợp kháng thể thỏ với FITC 66
3.2.7. Phương pháp xét nghiệm kháng thể kháng nhân – ANA (antinuclear antibody) . 68
4. KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN 72
4.1. Nguyên liệu 72
4.1.1. Thu hồi IgGngười từ huyết thanh . 72
4.1.2. Tinh sạch Fcγngười 74
4.2. Tạo kháng huyết thanh thỏ . 77
4.2.1. Kiểm tra đáp ứng mẫn cảm . 77
4.2.2. Thu kháng huyết thanh thỏ 79
4.3. Sắc ký ái lực để tinh chế IgG thỏ đặc hiệu với Fcγngười . 79
4.3.1. Sắc ký ái lực Sepharose–Fcγngười 79
4.3.2. Sắc ký ái lực Sepharose – IgGngười . 80
4.3.3. Điện di kiểm tra độ tinh sạch của KT thỏ sau khi qua hai cột SKAL 81
4.4. Cộng hợp IgGthỏ đặc hiệu với Fcγngười với FITC 82
4.4.1. Tỉ lệ cộng hợp FITC vào IgGthỏ . 82
4.4.2. Kết quả sử dụng FITC– khángFcg tho IgG và khả năng chẩn đoán 84
5. KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 85
5.1. Kết luận 86
5.2. Đề nghị . 86
PHỤ LỤC i
PHỤ LỤC 1: THÔNG TIN BỆNH NHÂN i
Mục lục
PHỤ LỤC 2: SẮC KÝ ĐỒ SKAL . ii
PHỤ LỤC 3: CỘNG HỢP FITC v