Thạc Sĩ Tạo và khảo sát hoạt tính sinh học in vitro của thụ thể interleukin-33 dạng tự do được biểu hiện từ

LỜI MỞ ĐẦU

Interleukin(IL)-33 là thành viên mới nhất của họ cytokine tiền viêm IL-1 có vai trò quan trọng trong hoạt động của hệ thống miễn dịch bảo vệ cơ thể. Tuy nhiên, hoạt động bất thường của IL-33 được chứng minh là có liên quan đến các bệnh dị ứng và viêm như hen suyễn, viêm da dị ứng, viêm thấp khớp . Do đó, ức chế hoạt động của IL-33 có thể là một giải pháp mới để góp phần điều trị các bệnh nêu trên.
Mục tiêu của nghiên cứu: tạo ra protein lai msIL-33R:Fc hIgG1 (thụ thể IL-33 dạng tự do của chuột gắn với vùng Fc IgG1 của người) biểu hiện từ tế bào HEK293 (Human Embryo Kidney) có hoạt tính sinh học ức chế hoạt động của IL-33. msIL- 33R:Fc hIgG1 ức chế IL-33 bằng cách bắt lấy IL-33 tự do qua đó hạn chế sự tác động của cytokine này lên tế bào đích thông qua thụ thể của nó trên bề mặt tế bào.
Nội dung nghiên cứu bao gồm:
1. Tạo dòng plasmid pmsIL33R-Fc mang gen mã hóa protein msIL- 33R:Fc hIgG1
2. Biểu hiện và thu nhận protein tái tổ hợp msIL-33R:Fc hIgG1 từ tế bào người HEK293
3. Phân tích một số đặc điểm của protein tái tổ hợp msIL-33R:Fc hIgG1
4. Biểu hiện IL-33 chuột có đánh dấu biotin (bio-mIL33) từ vi khuẩn E.coli
5. Khảo sát sự tương tác của msIL-33R:Fc hIgG1 với bio-mIL33 trong điều kiện in vitro
6. Khảo sát sự cạnh tranh của msIL-33R:Fc hIgG1 với IL-33R biểu hiện ở bề mặt tế bào trong việc tương tác với bio-mIL33
7. Đánh giá khả năng ức chế hoạt động IL-33 của msIL-33R:Fc hIgG1 trên mô hình tế bào EL-4 nuôi cấy in vitro
Phần tổng quan tài liệu sẽ tóm tắt các hiểu biết hiện nay về hệ IL-33/IL-33R và một số vấn đề có liên quan đến đề tài nghiên cứu.


MỤC LỤC

Lời cảm ơn . i
Mục lục . ii
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt . vi
Danh mục các bảng viii
Danh mục các hình . ix
LỜI MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 2
1.1. Vai trò của IL-33 trong sinh lý và bệnh lý 2
1.1.1. Vai trò của IL-33 trong sinh lý 2
1.1.2. Vai trò của IL-33 trong bệnh lý . 3
1.2. Đặc điểm sinh học của IL-33 6
1.2.1. Cấu trúc của IL-33 6
1.2.2. Tế bào sinh tổng hợp và tế bào đích của IL-33 7
1.2.3. IL-33 ngoại bào và nội bào 8
1.2.4. Con đường truyền tín hiệu của IL-33 thông qua IL-33R 9
1.3. Đặc điểm sinh học của IL-33R . 10
1.3.1. Cấu trúc của IL-33R 10
1.3.2. Tương tác của IL-33 với IL-33R . 11
1.3.3. IL-33R dạng tự do . 12
1.4. Ức chế hoạt động của IL-33 là một liệu pháp tìềm năng điều trị
các bệnh viêm – dị ứng . 12
1.5. Sơ lược về các dược phẩm ức chế hoạt động cytokine dựa trên nguyên tắc
tương tác cạnh tranh 14
1.6. Hệ thống tế bào động vật biểu hiện protein tái tổ hợp . 16
CHƯƠNG 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP . 18
2.1. Vật liệu . 18
2.1.1. Plasmid . 18
iii
2.1.2. Hóa chất tạo dòng plasmid biểu hiện msIL-33R:Fc hIgG1 19
2.1.3. Hóa chất dùng trong nuôi cấy vi khuẩn E. coli . 19
2.1.4. Hóa chất nuôi cấy tế bào HEK293 và EL-4 . 19
2.1.5. Hóa chất dùng để biến nạp plasmid vào E.coli và HEK293 . 20
2.1.6. Hóa chất li giải tế bào, định lượng protein và thủy phân
nhóm đường trên glycoprotein . 20
2.1.7. Hóa chất dùng cho SDS-PAGE, Western Blot và
đồng kết tủa miễn dịch 20
2.1.8. Hóa chất ELISA 21
2.2. Phương pháp 22
2.2.1. Tạo plasmid biểu hiện protein tái tổ hợp msIL-33R:Fc hIgG1 . 22
2.2.1.1. Khuếch đại đoạn gen mã hóa cho sIL-33R của chuột . 22
2.2.1.2. Phân tích DNA bằng điện di trên gel agarose . 23
2.2.1.3. Tinh sạch DNA 23
2.2.1.4. Cắt hạn chế DNA bằng NotI và HindIII . 24
2.2.1.5. Phản ứng nối DNA bằng ligase 25
2.2.1.6. Biến nạp plasmid vào E. coli DH5α khả nạp 25
2.2.1.7. Tách chiết plasmid từ E. coli 26
2.2.2. Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn 27
2.2.2.1. Nuôi cấy E. coli DH5α . 27
2.2.2.2. Bảo quản E. coli DH5α mang plasmid . 27
2.2.2.3. Tạo tế bào khả nạp E. coli DH5α bằng phương pháp
hóa biến nạp . 27
2.2.3. Phương pháp nuôi cấy tế bào HEK293 . 28
2.2.4. Phương pháp nuôi cấy tế bào EL-4 . 29
2.2.5. Phương pháp biến nạp plasmid vào tế bào HEK293 29
2.2.6. Phương pháp phân giải tế bào . 30
2.2.7. Phương pháp Bradford định lượng protein 30
iv
2.2.8. Phương pháp thu nhận msIL-33R:Fc hIgG1từ dịch nuôi cấy
tế bào HEK293 . 31
2.2.9. Phương pháp thủy phân nhóm đường trên glycoprotein
msIL-33R:Fc hIgG1 bằng PNGase F . 32
2.2.10. Phương pháp tạo IL-33 chuột đánh dấu biotin . 32
2.2.11. Phương pháp SDS-PAGE, Western Blotting . 33
2.2.11.1. Điện di SDS-PAGE 33
2.2.11.2. Western Blotting 35
2.2.12. Phương pháp đồng kết tủa miễn dịch (co-immunoprecipitation) 36
2.2.12.1. Đồng kết tủa miễn dịch bio-mIL33 và msIL-33R:Fc hIgG1 . 36
2.2.12.2. Đồng kết tủa miễn dịch bio-mIL33 và FLAG-IL33R . 36
2.2.13. Phương pháp đánh giá khả năng ức chế IL-33 của
msIL-33R:Fc hIgG1 trên mô hình tế bào nuôi cấy . 37
2.2.14. Phương pháp ELISA định lượng mIL-2 38
CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 39
3.1. Tạo dòng plasmid pmsIL33R-Fc mang gen mã hóa protein
msIL-33R:Fc hIgG1 39
3.1.1. Khuếch đại, thu nhận đoạn gen mã hóa thụ thể IL-33 dạng tự do
của chuột và chuẩn bị vector Signal pIgplus cho tạo dòng . 39
3.1.2. Tạo plasmid Signal pIgplus tái tổ hợp mang gen mã hóa protein
msIL-33R:Fc hIgG1 40
3.2. Biểu hiện và thu nhận protein tái tổ hợp msIL-33R:Fc hIgG1 từ tế bào
người HEK293 . 42
3.3. Phân tích một số đặc điểm của protein tái tổ hợp msIL-33R:Fc hIgG1 . 44
3.3.1. Sự đường hóa của msIL-33R:Fc hIgG1 tái tổ hợp biểu hiện
từ HEK293 44
3.3.2. Protein msIL-33R:Fc hIgG1 được biểu hiện và tiết ra môi trường
ngoại bào ở dạng dimer . 46
3.4. Biểu hiện IL-33 chuột có đánh dấu biotin từ vi khuẩn E.coli 48
v
3.5. Sự tương tác của msIL-33R:Fc hIgG1 với bio-mIL33 trong điều kiện
in vitro 50
3.6. Sự cạnh tranh của msIL-33R:Fc hIgG1 với IL-33R biểu hiện ở bề mặt
tế bào trong việc tương tác với bio-mIL33 . 52
3.7. Khả năng ức chế hoạt động IL-33 của msIL-33R:Fc hIgG1 trên mô hình
tế bào EL-4 nuôi cấy in vitro 55
CHƯƠNG 4 – KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 59
4.1. Kết luận 59
4.2. Đề nghị . 59
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 60
PHỤ LỤC . 71