Luận Văn Tạo mô hình đái tháo đường trên chuột nhắt trắng và thử tác dụng hạ đường huyết của các dịch chiết t

Đồ án tốt nghiệp năm 2011
Đề tài: Tạo mô hình đái tháo đường trên chuột nhắt trắng và thử tác dụng hạ đường huyết của các dịch chiết từ nấm Hoàng chi Ganoderma colossum


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU . 1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Bệnh đái tháo đường (ĐTĐ) .3
1.1.1. Tình hình bệnh ĐTĐ trên thế giới và Việt Nam 3
1.1.2. Phân loại và cơ chế bệnh sinh của ĐTĐ . 4
1.2. Đái tháo đường với y học cổ truyền (YHCT) 6
1.2.1. Quan niệm của y học cổ truyền về ĐTĐ 6
1.2.2. Các thuốc đông y điều trị ĐTĐ 6
1.3. Phương pháp gây mô hình ĐTĐ trên động vật thực nghiệm 7
1.3.1. Một số mô hình gây ĐTĐ mô phỏng ĐTĐ type 1 trên động vật thực nghiệm 7
1.3.2. Streptozocin và ứng dụng trong mô hình ĐTĐ type1 8
1.4. Nấm Hoàng chi (Ganoderma colossum) .9
1.4.1. Đặc điểm chung 9
1.4.2. Phân bố sinh thái 10
1.4.3. Thành phần hóa học [3] 10
1.4.4. Tác dụng dược lý[7] . 13
1.4.5. Tình hình nghiên cứu về tác dụng hạ đường huyết của nấm Hoàng chi trên Thế giới và ở
Việt Nam 16
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18
2.1. Đối tượng nghiên cứu 18
2.1.1. Động vật nghiên cứu 18
2.1.2. Dược liệu nghiên cứu . 18
2.2. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu .19
2.3. Phương pháp nghiên cứu 23
2.3.1. Tạo mô hình ĐTĐ trên chuột nhắt trắng theo kiểu mô phỏng ĐTĐ typ 1 . 23
2.3.2. Phương pháp định lượng glucose huyết . 24
2.3.3. Các phương pháp định tính, định lượng các chất có hoạt tính sinh học trong nấm Hoàng chi25
2.3.4. Các phương pháp ngâm chiết . 28
2.3.5. Phương pháp nghiên cứu khả năng hạ đường huyết của dịch chiết trên chuột gây ĐTĐ 28
2.3.6. Phương pháp xử lý số liệu 29
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 31
3.1. Kết quả gây ĐTĐ mô phỏng ĐTĐ typ 1 trên chuột nhắt trắng 31
3.1.1. Nồng độ glucose huyết . 31
3.1.2. Khả năng dung nạp glucose 33
3.1.3. Khả năng dung nạp glucose sau khi uống các phân đoạn dịch chiết 34
3.2. Khảo sát một số thành phần hóa học cơ bản của quả thể nấm Hoàng chi Ganoderma
colossum 37
3.2.1. Thành phần chất xơ cellulose . 38
3.2.2. Thành phần polysacharide tổng số 40
3.2.3. Thành phần triterpenoid tổng số . 43
3.2.4. Định tính alkaloid tổng số 45
3.3. Kết quả các quá trình ngâm chiết 47
3.3.1. Chiết bằng nước nóng 47
3.3.2. Chiết phân đoạn 48
3.3.3. Chiết polysacharide thô 51
3.4. Tác dụng hạ đường huyết của các phân đoạn dịch chiết từ nấm Hoàng chi Ganoderma
colossum trên mô hình chuột gây ĐTĐ 53
Chương 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 56
4.1. Kết luận 56
4.2. Đề xuất ý kiến 56
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 57
Tài liệu tiếng Việt .57
Tài liệu tiếng Anh .58


MỞ ĐẦU
Đái tháo đường (ĐTĐ) là một trong những bệnh rối loạn chuyển hóa có mức
tăng nhanh chóng trong thời gian gần đây cả về số lượng cũng như chi phí điều trị,
ngày càng trở thành gánh nặng về kinh tế và xã hội đối với nhiều quốc gia trên thế
giới. Theo dự báo của các chuyên gia y tế từ những năm 90 của thế kỉ 20 “Thế kỉ 21 là
thế kỉ của các bệnh nội tiết và rối loạn chuyển hóa”. Theo WHO, năm 2025 sẽ có 300 -330 triệu người mắc bệnh, chiếm tỷ lệ khoảng 5.4% dân số toàn cầu, trong đó ĐTĐ
type 2 chiếm 85-95%. Với tốc độ phát triển nhanh chóng như hiện nay, bệnh ĐTĐ sẽ
trở thành “đại dịch” trên toàn thế giới và là một trong những nguyên nhân gây tử vong
hàng đầu ở các nước phát triển.
Việt Nam nằm trong số các quốc gia có số người mắc bệnh ĐTĐ tăng nhanh
nhất thế giới (PGS.TS Tạ Văn Bình). Số liệu điều tra quốc gia năm 2002-2003 tỷ lệ
mắc bệnh trong cả nước là 2.7%. Hiệp hội ĐTĐ quốc tế và WHO phân loại tỷ lệ mắc
bệnh ĐTĐ ở Việt Nam nằm trong khu vực các nước có tỷ lệ gia tăng ĐTĐ trong cộng
đồng khoảng 2%-4.99%.
Với nhu cầu điều trị và dự phòng ĐTĐ, hàng loạt các thuốc tổng hợp đã được
các tập đoàn, các công ty dược phẩm nghiên cứu và phát triển như sulfonylurea, các
biguanid, thiazolidindion dành cho ĐTĐ type 2 và insulin dành cho ĐTĐ type 1. Tuy
nhiên các thuốc có nguồn gốc tổng hợp không phải là giải pháp tối ưu đối với các nước
đang phát triển như Việt Nam, do giá thành điều trị cao, đồng thời thuốc có phản ứng
phụ và tác dụng không mong muốn. Thuốc có nguồn gốc thảo dược đang là hướng ưu
tiên phát triển với ưu điểm là nguồn dược liệu sẵn có, dễ sử dụng, giá thành rẻ, ít tác
dụng phụ, dễ được cộng đồng chấp nhận, đặc biệt là các nước kém phát triển và đang
phát triển.
Một trong số dược thảo đang được quan tâm nhất hiện nay là nấm Linh chi hay
còn gọi là Lục bảo Linh chi. Trong Lục bảo Linh chi phải kể đến nấm Hoàng chi với
những tính năng thần dược có tác dụng đặc biệt với các triệu chứng suy giảm miễn
dịch, căng thẳng thần kinh, suy sụp tinh thần. Điều đáng chú ý là nấm Hoàng chi có
tác dụng đặc biệt trong việc loại trừ chất cholesterol trong các thành mạch lọc sạch
máu thúc đẩy quá trình lưu thông máu; khôi phục tế bào đảo tụy; cải thiện cơ bản thiểu
năng insulin là nguyên nhân chính gây ra bệnh tiểu đường. Nghiên cứu của Lin JM
(1995) cho thấy nấm Hoàng chi có tác dụng phục hồi chức năng gan trong bệnh tiểu
đường và làm chậm quá trình phát bệnh ở những bệnh nhân mắc bệnh này.
Xây dựng các mô hình bệnh lý để thử thuốc có ý nghĩa quan trọng nhằm đáp ứng
những tiêu chuẩn về phát triển các sản phẩm thuốc mới của bộ Y tế Việt Nam và
WHO. Đã có một số mô hình ĐTĐ được áp dụng ở Việt Nam, tuy nhiên vẫn cần có sự
bổ sung nhằm mục đích hoàn thiện và phong phú các phương pháp đánh giá tác dụng
hạ đường huyết của thảo dược.
Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi tiến hành đề tài “Tạo mô hình đái tháo
đường trên chuột nhắt trắng và thử tác dụng hạ đường huyết của các dịch chiết từ nấm
Hoàng chi Ganoderma colossum” với các nội dung chính:
- Tạo mô hình ĐTĐ trên chuột nhắt trắng bằng Streptozocin
- Định tính, định lượng thành phần các chất có trong nấm Hoàng chi:
polysaccharide, triterpenoid, alkaloid, cellulose
- Thu dịch chiết nấm Hoàng chi
- Thử tác dụng hạ đường huyết của các dịch chiết từ nấm Hoàng chi trên chuột
nhắt trắng


Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Bệnh đái tháo đường (ĐTĐ)
Theo WHO, ĐTĐ là một hội chứng có đặc tính biểu hiện bằng tăng glucose
máu do hậu quả của việc thiếu hoặc mất hoàn toàn insulin hoặc do có liên quan đến sự
suy yếu trong bài tiết và hoạt động của insulin.
Các chuyên gia thuộc Uỷ ban chuẩn đoán và phân loại bệnh đái tháo đường Hoa
Kỳ đưa ra định nghĩa về bệnh đái tháo đường như sau: Đái tháo đường là một nhóm
các bệnh chuyển hóa có đặc điểm là tăng glucose trong máu, hậu quả của sự thiếu hụt
bài tiết insulin, khiếm khuyết trong hoạt động của insulin hoặc cả hai. Tăng glucose
máu mạn tính thường kết hợp với sự hủy hoại, sự tăng rối loạn chức năng và sự suy
yếu chức năng của nhiều cơ quan đặc biệt là mắt, thận, thần kinh, tim và mạch máu
[11,26].
1.1.1. Tình hình bệnh ĐTĐ trên thế giới và Việt Nam
* Trên thế giới:
ĐTĐ là bệnh không lây nhiễm có tốc độ phát triển nhanh chóng nhất trên thế
giới chủ yếu là các nước đang phát triển. Theo số liệu thống kê của Tổ chức Y tế thế
giới: năm 1995 cả thế giới có 135 triệu người mắc bệnh ĐTĐ chiếm 4% dân số thế
giới, đến năm 2010 có 221 triệu người và dự báo đến năm 2025 là 330 triệu người mắc
căn bệnh này, chiếm 5.4%. Cũng theo thống kê của WHO, cứ 30 giây lại có một người
mắc bệnh ĐTĐ bị cắt cụt chi; mỗi ngày có 5.000 người mất khả năng nhìn do biến
chứng về mắt của bệnh ĐTĐ; mỗi năm có khoảng 3.2 triệu người chết vì các bệnh liên
quan tới ĐTĐ. Như vậy, ĐTĐ đang là gánh nặng thực sự cho sự phát triển kinh tế, xã
hội và sức khỏe của con người toàn thế giới trong thế kỷ 21. Chính vì vậy, WHO đã
nhận định rằng: “Thế kỷ XXI là thế kỷ của các bệnh nội tiết và rối loạn chuyển hóa mà
điển hình là bệnh ĐTĐ. Những gì mà đại dịch HIV/AIDS đã hoành hành 20 năm cuối
thế kỷ XX, thì đó sẽ là ĐTĐ trong 20 năm đầu thế kỷ XXI”.
* Ở Việt Nam
Việt Nam không phải là nước có tỷ lệ bệnh nhân ĐTĐ cao nhất thế giới nhưng
lại là quốc gia có tốc độ phát triển nhanh nhất thế giới. Bên cạnh đó, biến chứng tim
mạch do bệnh ĐTĐ luôn là biến chứng phổ biến và là nguyên nhân gây đột quỵ và tử
vong hàng đầu ở người bệnh ĐTĐ.
Tại Việt Nam, cùng với sự tăng trưởng của nền kinh tế xã hội, tỷ lệ mắc bệnh
ĐTĐ trong 10 năm qua có xu hướng gia tăng. Tuy nhiên những số liệu về bệnh ĐTĐ
mới chỉ giới hạn ở một số thành phố lớn như Hà Nội, Huế, Thành phố Hồ Chí Minh,
Hải Phòng, trong lứa tuối 30-64 là 4.0%, tỷ lệ rối loạn dung nạp glucose là 5.1%, riêng
quận Hoàn Kiếm (Hà Nội) lên tới 7%. Phần lớn người bệnh phát hiện và điều trị
muộn. Vì vậy, mỗi năm có trên 70% bệnh nhân không được phát hiện và điều trị kịp
thời. Vùng đồng bằng, ven biển tỷ lệ mang bệnh ĐTĐ ở lứa tuối 30-64 là 2.7%.
1.1.2. Phân loại và cơ chế bệnh sinh của ĐTĐ
Năm 1997, Uỷ ban chuyên gia về chẩn đoán và phân loại bệnh ĐTĐ của WHO
đã đề nghị phân loại ĐTĐ mới dựa trên những tiến bộ khoa học trong những năm gần
đây. Phân loại này dựa vào hiểu biết về nguyên nhân sinh bệnh. Cách phân loại được
tóm tắt dưới đây:
a. Đái tháo đường type 1
Đái tháo đường type 1 là tình trạng tăng đường huyết mạn tính do hậu quả của
tình trạng thiếu hụt insulin tuyệt đối hoặc tương đối kèm theo các rối loạn chuyển hóa
protid, lipid. Các rối loạn này có thể đưa đến các biến chứng cấp tính và mạn tính.
Cơ chế bệnh sinh
Do yếu tố di truyền kém sản xuất insulin, phát bệnh tự nhiên, ít phụ thuộc vào
điều kiện môi trường. Bệnh gặp ở 0.2-0.5 % số người trong quần thể và chiếm 5-10%
số người mắc bệnh tiểu đường.
Các giai đoạn trong ĐTĐ type 1[11]:
- Giai đoạn 1: Bản chất di truyền–nhạy cảm gene
- Giai đoạn 2: Khởi phát quá trình tự miễn
- Giai đoạn 3: Phát triển một loạt các kháng thể
- Giai đoạn 4: Tổn thương chức năng tế bào β đảo tụy
- Giai đoạn 5: Đái tháo đường lâm sàng, phá hủy hoàn toàn hoặc gần như hoàn
toàn tế bào β đảo tụy. Biểu hiện lâm sàng là ĐTĐ phụ thuộc insulin có kèm biến
chứng.
Đặc điểm lâm sàng
Bệnh nhân ĐTĐ type 1 có đặc điểm lâm sàng phức tạp. Thiếu hụt insulin tuyệt
đối làm tăng đường huyết và axit béo quá mức dẫn tới tăng áp lực thẩm thấu và tăng
thể ceton trong máu. Bệnh nhân thường đi tiểu nhiều, khát nhiều, sụt cân, mờ mắt, mệt
mỏi
Điều trị
Bệnh nhân ĐTĐ type1 bắt buộc phải điều trị bằng insulin.
Insulin là hormon do tế bào β trong tuyến tụy bài tiết dưới dạng preproinsulin,
sau đó được cắt nhỏ hơn để tạo thành proinsulin. Cấu tạo phân tử insulin gồm 2 chuỗi
peptid, chuỗi A có 21 acid amin, chuỗi B có 30 acid amin. Hai chuỗi này liên kết với
nhau bằng hai cầu disulfid, khi hai chuỗi này tách nhau thì hoạt tính của insulin sẽ biến
mất.


TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Đào Văn Phan, Nguyễn Khánh Hòa, Phạm Hữu Điển (2005), Tác dụng hạ đường
huyết của Bạch truật, Câu kỷ tử và Cam thảo nam trên chuột nhắt trắng, Tạp chí
Nghiên cứu Y học, 38 (5), tr.12-16.
2. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Trung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ
Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị
Nhu, Nguyễn Tập, Trần Toàn (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam tập
1, NXB Khoa học và kỹ thuật, tr.260-262.
3. Lê Xuân Thám (1998), Nấm Linh chi cây thuốc quý, NXB khoa học và kỹ thuật,
Hà Nội.
4. Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu hóa học
cây thuốc, Nhà xuất bản Y học, TPHCM.
5. Nguyễn Phước Nhuận (2001), Giáo trình sinh hóa học, phần 1. Nhà xuất bản Đại
học Quốc gia TPHCM.
6. Nguyễn Phương Dung, Lê Võ Định Tường (2001), Kết quả bước đầu nghiên cứu
một số cây thuốc, bài thuốc chữa bệnh đái tháo đường, Tạp chí Y học thực hành, 8,
tr.50-52.
7. Nguyễn Thượng Dong (2007), Nấm Linh chi, NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà
Nội.
8. Nguyễn Thị Hoàng Diễm, Võ Phùng Nguyên, Nguyễn Thị Bay, Tác dụng hạ
glucose huyết của 2 bài thuốc Khổ qua và lục vị tri bá trên chuột nhắt trắng đái tháo
đường, Khoa Dược, Khoa Y học cổ truyền- Đại học Y dược TP.HCM.
9. Phạm Thị Ánh Hồng (2003), Kỹ thuật sinh hóa, NXB ĐH Quốc gia TPHCM.
10. Trần Hùng (2004), Phương pháp nghiên cứu dược liệu, Đại học Y dược TP
HCM.
11. Tạ Văn Bình (2007), Những nguyên lý nền tảng bệnh đái tháo đường, tăng
glucose máu, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
12. Vũ Ngọc Lộ (2005), Những dược liệu có tác dụng hạ đường huyết và trị tiểu
đường, Tạp chí Dược học, 353, tr.7-8.
Tài liệu tiếng Anh
13. Antonios Chatzigeorgiou, Antonios Halapas, Konstannious Kalafatakis and Elli
Kamper (2009), The Use of Animal Model in the Study of Diabetes Mellitus, pp.245-258.
14. Bojana Boh, Damjan Hodzar, Danica Dolnicar, Marin Berovic and Franc
Pohleven (2000), Isolation and quantification of Triterpenoid acids from Ganoderma
applanatum of Istrian Origin. Food technol. biotechnol. 38 (1), pp.11-18
15. Choi, Seung Hee, Kim Byong Kak, HaWon Kim, Jin Hwan Kwak, Eung Chil
Choi, Young Choong Kim, Young-Bok Yoo, Yong Hwan Park. Studies on Protoplast
Formation and Regeneration of Ganoderma lucidum. Archives of Phamacal Research,
10 (3). (1992), 158-158.
16. Qian Yang, Siwang Wang, YanHua Xie, Jiyuan Sun, Jian BoWang (2010),
HPLC analysis of ganoderma lucidum polysaccharides and its effect on antioxidant
enzymes activity and Bax, Bcl-2 expression, International journal of biological
macromolecules 46, pp.167-172
17. Ram, high-dose streptozotocin induction protocol (Mouse), Animal model of
diabetic complications consortium, the University of Michigan Medical Center, Frank
Brosius, pp.1-3.
18. S.W. Seto, T.Y. Lam, H.L. Tam, A.L.S. Au, S.W. Chan, J.H. Wu, P.H.F. Yu,
G.P.H. Leung, S.M.Y. Lee, Y.W. Kwan (2009), Novel hypoglycemic effects of
Ganoderma lucidum water-extract in diabetic mice. Phytomedicine 16, pp.426-436
19. Sajad Hussain Mir, Abdul Baqui, R.C. Bhagat, M.M Darzi and Abdulwabid Shah
post graduate Department of Zoology, university of Kashmir, Srinagar, Biochemical
and His tomorphological study of Streptozotocin induced Diabetes Mellitus in Rabbits,
Pakistan Journal of Nutrition 7 (2).
22. Wentao Xu, Fangfang Zhang, YunBo Luo, Liyan Ma, Xiaohong Kou, Kunlun
Huang (2009), Antioxidant activity of a water-soluble polysaccharide purified from
Pteridium aquilinum, Carbohydrate research, pp.217-222