Thạc Sĩ Tạo kháng thể đơn dòng kháng protein E7 của Human papillomavirus type 16

MỞ ĐẦU

Kể từ khi công trình nghiên cứu về phương pháp tạo tế bào lai (hybridoma) do hai nhà khoa học Cesar Milstein và Georges Kohler được công bố, kháng thể đơn dòng đang được phát triển một cách nhanh chóng, và dần trở nên quan trọng trong cuộc chiến chống lại bệnh tật. Chúng được sử dụng như là công cụ chẩn đoán cũng như điều trị cho nhiều bệnh ung thư.
Ung thư cổ tử cung (UTCTC) là căn bệnh ung thư phổ biến ở phụ nữ trên thế giới, hằng năm có khoảng 250.000 người tử vong vì căn bệnh này. Ở Việt Nam mỗi năm có khoảng 5.174 ca mắc và 2.472 ca tử vong vì UTCTC [32]. Do đó, việc nghiên cứu, phát triển các phương pháp chẩn đoán sớm, hiệu quả để giảm thiểu tỉ lệ tử vong do UTCTC là rất cần thiết.
Nhằm mục đích phát triển một phương pháp chẩn đoán UTCTC hiệu quả, dễ thực hiện, dễ tiếp cận, chi phí thấp đối với bệnh nhân và có thể triển khai rộng rãi, chúng tôi thực hiện đề tài “Tạo kháng thể đơn dòng kháng protein E7 của Human papillomavirus type 16”. Ngoài ra, kết quả của luận văn này cũng sẽ góp phần hoàn thiện quy trình sản xuất kháng thể đơn dòng tại Việt Nam với nhiều ứng dụng đa dạng. Luận văn được thực hiện với mục tiêu chính là tạo kháng thể đơn dòng kháng protein E7 của HPV type 16, đây là protein của HPV type nguy cơ cao có thể sử dụng như một chỉ thị phân tử quan trọng cho việc chẩn đoán và theo dõi diễn tiến của UTCTC. Nội dung của của luận văn này tập trung vào các điểm sau:
- Tạo các dòng tế bào lai sản xuất KTĐD kháng protein E7 của HPV-16 từ nguồn kháng nguyên là protein tái tổ hợp được tinh sạch.
- Sản xuất và thu nhận KTĐD kháng protein E7 của HPV-16 bằng phương pháp nuôi cấy in vitro các dòng tế bào lai.
- Kiểm tra các đặc tính của KTĐD thu nhận được bằng phương pháp Western blot, miễn dịch huỳnh quang, ELISA.
MỤC LỤC

Lời cảm ơn
MỤC LỤC i
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT . v
DANH MỤC CÁC BẢNG . vii
DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ .viii
MỞ ĐẦU . 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. HUMAN PAPILLOMAVIRUS VÀ UNG THƯ CỔ TỬ CUNG . 3
1.1.1. Sơ lược về tình hình ung thư cổ tử cung trên thế giới và Việt Nam 3
1.1.2. UTCTC do Human papillomavirus 4
1.1.3. Chu trình xâm nhiễm của HPV 5
1.2. PROTEIN E7 HUMAN PAPILLOMAVIRUS TYPE NGUY CƠ CAO 6
1.2.1. Cấu trúc protein E7 6
1.2.2. Vai trò của protein E7trong phát sinh ung thư 7
1.3. KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG 10
1.3.1. Cấu trúc của kháng thể . 10
1.3.2. Sự tương tác giữa kháng nguyên và kháng thể . 11
1.3.3. Kháng thể đơn dòng và một số ứng dụng . 13
1.4. SẢN XUẤT KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG BẰNG KỸ THUẬT TẠO TẾ BÀO LAI (HYBRIDOMA) . 14
1.4.1. Các bước chính trong sản xuất KTĐD . 15
1.4.2. Một số công trình trong và ngoài nước liên quan đến việc tạo KT ĐD kháng protein E7 của Human papillomavirus 24
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP
2.1. VẬT LIỆU 26
2.1.1. Tế bào 26
2.1.2. Kháng nguyên 26
2.1.3. Chuột dùng gây đáp ứng miễn dịch 26
2.1.4. Hóa chất – Môi trường: 27
2.2. PHƯƠNG PHÁP . 31
2.2.1. Gây đáp ứng miễn dịch trên chuột . 31
2.2.2. Dung hợp tạo tế bào lai (hybridoma) 32
2.2.3. Phương pháp nhân dòng tế bào lai sản xuất KTĐD in vitro và thu nhận
KTĐD 35
2.2.4. Phương pháp điện di SDS-PAGE kiểm tra độ tinh sạch của KTĐD . 36
2.2.5. Phương pháp ELISA 36
2.2.6. Phương pháp chuyển gene vào tế bào CHO-K1 . 37
2.2.7. Xác định ái lực của các KTĐD bằng phương pháp ELISA . 37
2.2.8. Các phương pháp kiểm tra đặc tính của KTĐD 38
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ - THẢO LUẬN
3.1. TẠO CÁC DÒNG TẾ BÀO LAI SẢN XUẤT KTĐD KHÁNG PROTEIN E7 HPV-16 41
3.1.1. Kết quả gây đáp ứng miễn dịch chuột BALB/c 41
3.1.2. Kết quả dung hợp tạo tế bào lai sản xuất KTĐD 42
3.1.3. Kết quả sàng lọc các dòng tế bào lai tạo kháng thể kháng protein E7 HPV-
16 42
3.2. THU NHẬN KTĐD TỪ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY TẾ BÀO . 44
3.2.1. Xác định isotype của KTĐD 44
3.2.2. Kết quả thu nhận KTĐD 45
3.3. CÁC ĐẶC TÍNH CỦA KTĐD 46
3.3.1. Xác định hằng số ái lực của KTĐD 46
3.3.2. Tính đặc hiệu của KTĐD với protein E7 HPV-16 tái tổ hợp 49
3.3.3. Tính đặc hiệu của KTĐD với protein E7 HPV-16 biểu hiện tự nhiên trong tế bào CaSki . 53
CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN . 58
TÀI LIỆU THAM KHẢO 59
PHỤ LỤC . 62