Thạc Sĩ Tạo dòng và thiết kế Vector biểu hiện gen mã hoá yếu tố VIII của người

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ . 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1. TÌNH HÌNH MẮC BỆNH HEMOPHILIA A TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 4
1.2. LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU BỆNH HEMOPHILIA A 5
1.3. SINH LÝ HỌC BỆNH HEMOPHILIA A . 7
1.4. BỆNH HEMOPHILIA A . 7
1.4.1. Đại cương về đông máu 8
1.4.2. Các yếu tố đông máu 8
1.4.3. Quy luật di truyền 10
1.4.4. Chẩn đoán 11
1.5. ĐIỀU TRỊ THAY THẾ YẾU TỐ VIII . 13
1.5.1. Huyết tương tươi đông lạnh 13
1.5.2. Tủa lạnh yếu tố VIII . 13
1.5.3. Yếu tố VIII cô đặc . 14
1.5.4. Yếu tố VIII tái tổ hợp 14
1.6. CÁC TÁC DỤNG KHÔNG MONG MUỐN KHI SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP TRUYỀN MÁU 15
1.6.1. Do bất đồng miễn dịch 15
1.6.2. Lây nhiễm các bệnh nhiễm trùng qua đường máu 15
1.6.3. Do truyền máu khối lượng lớn 16
1.7. VỊ TRÍ, CẤU TRÚC, CHỨC NĂNG CỦA GEN MÃ HÓA YẾU TỐ VIII 17
1.8. PROTEIN YẾU TỐ VIII . 17
1.9. CÁC ĐỘT BIẾN GÂY BỆNH HEMOPHILIA A 19
1.9.1. Sự mất đoạn của gen yếu tố VIII 19
1.9.2. Đột biến thay đổi nucleotid trên gen yếu tố VIII 20

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .22

2.1. NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT . 22
2.1.1. Nguyên liệu . 22
2.1.2. Thiết bị 22
2.1.3. Hóa chất 22
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 24
2.2.1. Tách chiết RNA tổng số từ mô gan người 24
2.2.2. Xác định nồng độ, độ sạch RNA, cDNA bằng phương pháp quang phổ kế 25
2.2.3. Phương pháp điện di acid nucleic 26
2.2.4. Tổng hợp cDNA sử dụng phương pháp MMLV-RT . 27
2.2.5. Khuếch đại 2 đoạn gen A1A2 và A3C2 mã hoá yếu tố VIII . 28
2.2.6. Tách dòng 2 đoạn gen A1A2 và A3C2 mã hoá yếu tố VIII 30
2.2.7. Thiết kế vector biểu hiện yếu tố VIII . 36
2.2.8. Giải trình tự gen 43

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ .45

3.1. Tách chiết RNA tổng số từ mô gan người . 45
3.2. Tổng hợp cDNA . 46
3.3. Khuyếch đại 2 đoạn gen A1A2 và A3C2 mã hoá yếu tố VIII 46
3.4. Tách dòng 2 đoạn gen A1A2 và A3C2 mã hoá yếu tố VIII 47
3.4.1. Kiểm tra hiệu quả tách dòng bằng phản ứng PCR 47
3.4.2. Kiểm tra hiệu quả tách dòng bằng enzym cắt giới hạn . 49
3.5. Đưa 2 đoạn gen A1A2 và A3C2 mã hoá yếu tố VIII vào vector biểu hiện 51
3.5.1. Đưa đoạn gen A1A2 và A3C2 vào vector biểu hiện 51
3.5.2. Đưa đoạn gen A1A2 vào vector biểu hiện đã mang đoạn gen A3C2 56

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 62

4.1. TÁCH CHIẾT RNA TỔNG SỐ VÀ TỔNG HỢP cDNA 62
4.2. KHUẾCH ĐẠI VÀ TÁCH DÒNG HAI ĐOẠN GEN A1A2 VÀ A3C2 . 64
4.3. THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN YẾU TỐ VIII 66

KẾT LUẬN .73

HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO .74
TÀI LIỆU THAM KHẢO

ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh Hemophilia hay còn gọi là bệnh ưa chảy máu. Đây là một bệnh di truyền do thiếu hụt hay bất thường chức năng của các yếu tố đông máu huyết tương, như các yếu tố VIII, IX hay XI. Bệnh đặc trưng bởi thời gian đông máu kéo dài và tăng nguy cơ chảy máu. Biểu hiện lâm sàng chủ yếu là xuất huyết. Xuất huyết có thể tự nhiên hoặc sau chấn thương nhẹ. Đặc điểm xuất huyết là các đám máu bầm dưới da, tụ máu trong cơ, chảy máu ở các khớp. Tỷ lệ mắc bệnh Hemophilia ở các nước khác nhau nhưng có tần suất chung khoảng 30- 100/1.000.000 dân [41 . Ở nước ta, theo thống kê của Viện Huyết học và Truyền máu TW có khoảng 5.000 bệnh nhân Hemophilia nhưng chỉ mới phát hiện và điều trị đặc hiệu khoảng 20% các trường hợp [28].
Hemophilia là bệnh di truyền lặn liên quan đến giới tính, gen bệnh nằm trên nhiễm sắc thể X. Người mẹ mang gen bệnh có khả năng truyền bệnh cho 50% con trai của họ, do vậy chủ yếu bệnh nhân là nam. Có 3 loại Hemophilia, sự giảm yếu tố VIII gây ra bệnh Hemophilia A, thiếu hụt yếu tố IX gây Hemophilia B và bất thường yếu tố XI sẽ gây bệnh Hemophilia C. Trong đó, bệnh Hemophilia A là phổ biến hơn cả, chiếm khoảng 85%, Hemophilia B chỉ chiếm 15-20% các trường hợp [9,40]. Tần suất mắc bệnh Hemophilia A là
1/5.000 trẻ trai. Ở bệnh nhân thể nặng, nồng độ protein yếu tố VIII trong máu rất thấp, chỉ chiếm ≤ 1% so với người bình thường (nồng độ yếu tố VIII bình thường là 200 ng/ml).

Việc chẩn đoán chính xác và điều trị sớm có một ý nghĩa rất quan trọng để hạn chế tối đa tình trạng chảy máu cũng như giảm thiểu khả năng trở thành tàn tật nhằm đưa bệnh nhân hòa nhập với cộng đồng. Điều trị Hemophilia bao gồm: điều trị chảy máu, điều trị dự phòng và phục hồi chức năng, trong đó việc sử dụng các chế phẩm thay thế đóng vai trò chủ chốt. Trong những năm vừa qua, mặc dù đã có nhiều tiến bộ trong điều trị bệnh như truyền máu toàn phần, huyết tương, huyết tương tươi đông lạnh, tủa lạnh yếu tố VIII, yếu tố cô đặc từ độ tinh khiết thấp đến yếu tố cô đặc độ tinh khiết cao. Nhưng như chúng ta đều biết các sản phẩm có nguồn gốc từ máu thường có giá thành rất đắt, thời gian bán hủy ngắn nên phải tiêm tĩnh mạch đều đặn và nguồn cung hạn hẹp trong khi nhu cầu điều trị ngày một gia tăng, hơn nữa các sản phẩm có nguồn gốc từ máu không phải là tuyệt đối an toàn, mặc dù các tiến bộ y học cho phép chúng ta loại bỏ hầu hết các nguy cơ gây bệnh có trong các sản phẩm kể trên. Bệnh nhân sử dụng các phương pháp điều trị này vẫn có nguy cơ tiềm ẩn mắc các bệnh lây nhiễm qua đường truyền máu như HIV, HBV, HCV . Năm 1999, theo hiệp hội Hemophilia thế giới công bố tỷ lệ nhiễm HIV ở bệnh nhân Hemophilia A điều trị tủa yếu tố VIII tại Venezuela là 40% [57]. Một nghiên cứu khác được thực hiện ở một số nước cho thấy 80% bệnh nhân Hemophilia bị nhiễm virus viêm gan do truyền máu và các chế phẩm của máu. Ở Việt Nam, nghiên cứu của Nguyễn Thị Mai cho thấy 32,9% số bệnh nhân Hemophilia bị nhiễm HCV do điều trị các chế phẩm từ máu [9]. Như vậy việc sử dụng các chế phẩm thay thế trong điều trị bệnh Hemophilia A đóng vai trò đặc biệt quan trọng và mang lại những lợi ích hết sức thiết thực.

Trên thế giới với sự phát triển của khoa học kỹ thuật và những thành tựu trong công nghệ gen, các nước tiên tiến đã sản xuất thành công yếu tố VIII tái tổ hợp áp dụng trong điều trị. Ưu điểm của sinh phẩm này là hàm lượng yếu tố VIII cao, có hiệu quả rõ rệt, dễ bảo quản, không sinh ra kháng thể và đặc biệt là không chứa các yếu tố nguy cơ gây các bệnh truyền nhiễm. Vì vậy yếu tố VIII tái tổ hợp ngày càng được ứng dụng một cách rộng rãi để điều trị Hemophilia A. Trong những năm gần đây, đã có nhiều thử nghiệm lâm sàng ở người về điều trị Hemophilia A bằng liệu pháp gen và đã đem lại triển vọng đầy hứa hẹn cho bệnh nhân Hemophilia A.

Việt Nam là một nước có tỉ lệ mắc bệnh Hemophillia A khá cao trong cộng đồng. Phương pháp điều trị hiện nay ở nước ta là sử dụng yếu tố VIII trong máu toàn phần (truyền trực tiếp hoặc tách chiết) rất tốn kém và hiệu quả không cao. Chính vì vậy việc nghiên cứu đề tài Tạo dòng và thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa yếu tố VIII của người là một việc làm cần thiết có ý nghĩa khoa học và thực tiễn, mang tính nhân đạo, đem lại hiệu quả kinh tế cao. Đây là một tiền đề quan trọng cho nghiên cứu tiếp theo nhằm mục đính sản xuất yếu tố VIII tái tổ hợp ứng dụng trong điều trị bệnh Hemophilia A ở nước ta. Do vậy chúng tôi tiến hành đề tài này với mục tiêu:

1. Tách chiết và khuyếch đại vùng gen mã hóa yếu tố VIII thích hợp.
2. Thiết kế vector biểu hiện mang đoạn gen mã hóa yếu tố VIII đã được tách chiết và khuyếch đại.