Thạc Sĩ Tạo dòng và biểu hiện enzyme trehalose synthase chịu nhiệt từ vi khuẩn Meiothermus ruber phân lập từ

MỞ ĐẦU

Các vi sinh vật chịu nhiệt được xếp trong nhóm vi sinh vật cực đoan phân bố nhiều ở các vùng suối nước nóng, các vùng địa nhiệt, miệng núi lửa . Nhiệt độ cực thuận nhất cho sự hoạt động của các vi sinh vật chịu nhiệt này là từ 50 – 80°C. Một số vi sinh vật có thể hoạt động ở nhiệt độ 110°C hoặc cao hơn. Những enzyme của những chủng vi khuẩn này được gọi là những enzyme chịu nhiệt. Các enzyme chịu nhiệt này có những đặc tính về cấu trúc, chức năng khác thường cho sự chịu nhiệt độ cao và hoạt động cực thuận của chúng. Vì vậy, việc phân lập các chủng vi khuẩn chịu nhiệt này đồng thời tìm hiểu các enzyme chịu nhiệt của chúng sẽ mở ra một hướng mới trong việc ứng dụng các enzyme này trong cách lĩnh vực sinh hóa, thực phẩm và đặc biệt là trong lĩnh vực công nghệ sinh học phân tử.
Trehalose là một trong những loại đường có nhiều công dụng đối với cuộc sống con người, đặc biệt đối với những người béo phì, những người mắc bệnh tiểu đường Trehalose hiện nay đang được sử dụng như một loại đường thay thế trong công nghiệp sản xuất bánh kẹo, sữa Trong khi đó việc tổng hợp trực tiếp trehalose rất phức tạp. Do vậy việc tìm kiếm một phương pháp tổng hợp trehalose là hết sức cần thiết.
Trehalose synthase là enzyme tổng hợp trehalose từ maltose. Trehalose synthase được tìm thấy trong nhiều loại vi khuẩn, trong đó có vi khuẩn Meiothermus ruber. Đây là một chủng vi khuẩn chịu nhiệt trung bình. Ở Việt Nam, chúng được tìm thấy ở hầu hết trong các suối nước nóng có nhiệt độ trung bình từ 45-75oC. Phân lập chủng vi khuẩn này đồng thời tạo dòng đoạn gen mã hóa enzyme Trehalose synthase chịu nhiệt của chúng không chỉ có ý nghĩa khoa học mà còn có ý nghĩa kinh tế xã hội. Vì thế chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Tạo dòng và biểu hiện enzyme trehalose synthase chịu nhiệt từ vi khuẩn Meiothermus ruber phân lập từ vùng suối nước nóng ở Việt Nam”

NỘI DUNG CỦA ĐỀ TÀI

 Phân lập các chủng vi khuẩn chịu nhiệt Meiothermus ruber từ suối nước nóng ở Bình Châu ( Bà Rịa - Vũng Tàu).
 Định danh chủng vi khuẩn này dựa vào trình tự gen 16S rRNA.
 Ly trích DNA bộ gen của chủng vi khuẩn Meiothermus ruber.
 Phân lập đoạn gen mã hóa cho enzyme Trehalose synthase.
 Tái tổ hợp đoạn gen này vào chủng E.coli và biểu hiện chủng E.coli tái tổ hợp.

MỤC LỤC

Trang phụ bìa
MỤC LỤC . i
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT . v
DANH MỤC CÁC HÌNH vi
DANH MỤC CÁC BẢNG vii
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN . 4
1.1. ĐẶC ĐIỂM CỦA VI KHUẨN CHỊU NHIỆT . 5
1.1.1. Sự phân bố của vi khuẩn chịu nhiệt 5
1.1.2. Phát sinh loài 5
1.1.3. Vi khuẩn Meiothermus ruber . 6
1.2. TREHALOSE . 6
1.2.1. Cấu trúc của Trehalose 6
1.2.2. Bản chất sinh học của trehalose 7
1.2.3. Đặc tính hóa học của trehalose . 9
1.2.4. Ảnh hưởng của Trehalose lên cơ thể vi sinh vật . 10
1.2.4.1. Là một nguồn dự trữ năng lượng và carbon . 10
1.2.4.2. Là một chất ổn định và bảo vệ của các protein và màng . 11
1.2.5. Ảnh hưởng của Trehalose lên cơ thể con người 12
1.2.5.1. Ảnh hưởng của Trehalose đến sự chuyển hóa hydratcacbon 12
1.2.5.2. Vai trò thúc đẩy quá trình hấp thụ canxi của Trehalose 13
1.2.5.3. Ảnh hưởng của Trehalose đến hệ vi sinh vật trong khoang miệng . 13
1.2.6. Con đường tổng hợp trehalose 14
1.2.7. Ứng dụng của trehalose 17
1.2.8. Sản xuất trehalose 18
1.2.9. Tình hình nghiên cứu enzyme trehalose synthase trên thế giới . 19
1.3. KỸ THUẬT TẠO DÒNG . 21
1.3.1. Chọn và xử lý vector 21
1.3.2. Xử lý DNA cần tạo dòng 21
1.3.3. Tạo vector tái tổ hợp 21
1.3.4. Chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào chủ . 22
1.3.4.1. Hóa biến nạp . 22
1.3.4.2. Điện biến nạp 22
1.3.5. Chọn lọc dòng tái tổ hợp: . 22
Chương 2: VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 24
2.1. VẬT LIỆU 25
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu . 25
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ 25
2.1.3. Môi trường làm thuần và cấy chuyền vi khuẩn ưa nhiệt . 25
2.1.4. Hóa chất dùng cho tách chiết DNA 26
2.1.5. Hóa chất dùng cho phản ứng PCR: . 27
2.1.6. Mồi dùng cho giải trình tự 27
2.1.7. Hóa chất dùng cho các phản ứng cắt, nối DNA 27
2.1.8. Hóa chất dùng cho điện di trên gel agarose 27
2.1.9. Môi trường, hóa chất dùng cho biến nạp và biểu hiện 28
2.1.10. Hóa chất dùng cho điện di trên gel polyacrylamide 28
2.1.11. Hóa chất dùng cho tinh chế DNA từ thạch agarose . 29
2.1.12. Hóa chất dùng cho tinh chế plasmid . 29
2.1.13. Hóa chất dùng cho phương pháp Western blot . 29
2.2. PHƯƠNG PHÁP 30
2.2.1. Phương pháp thu mẫu 30
2.2.2 Phương pháp làm giàu và phân lập vi khuẩn Meiothermus ruber . 30
2.2.3. Phương pháp định danh vi khuẩn Meiothermus ruber 30
2.2.3.1. Khảo sát hình thái tế bào . 30
2.2.3.2. Giải trình tự gen 31
2.2.4. Phương pháp tách chiết DNA vi khuẩn . 31
2.2.5. Phương pháp PCR 31
2.2.6. Phương pháp điện di trên gel agarose . 32
2.2.7. Phương pháp tinh chế DNA từ thạch agarose . 32
2.2.8. Phản ứng cắt DNA bằng enzyme cắt giới hạn 32
2.2.9. Phản ứng ghép nối đoạn DNA vào vector pJet1.2 blunt 33
2.2.10. Phản ứng nối đoạn DNA chèn vào vector pET-22b 33
2.2.11. Chuyển DNA vào E.coli bằng phương pháp hóa biến nạp 34
2.2.11.1. Nguyên tắc 34
2.2.11.2. Cách tiến hành . 35
2.2.12. Ly trích DNA plasmid của E.coli theo phương pháp DNA-spin . 35
2.2.13. Kiểm tra sản phẩm tạo dòng . 35
2.2.14. Biểu hiện protein tái tổ hợp 36
2.2.15. Điện di phân tách protein trên gel polyacrylamide ( SDS-PAGE) . 36
2.2.15.1 Nguyên tắc 36
2.2.15.2. Cách tiến hành . 36
2.2.16.Phân tích protein bằng phương pháp Western blot . 38
2.1.16.1. Nguyên tắc 38
2.1.16.2. Cách tiến hành . 38
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ BÀN LUẬN 40
3.1. PHÂN LẬP CHỦNG VI KHUẨN MEIOTHERMUS RUBER Từ SUỐI NƯỚC NÓNG . 41
3.2.THU NHẬN GEN MÃ HÓA ENZYME TREHALOSE SYNTHASE TỪ CHỦNG VI KHUẨN MEIOTHERMUS RUBER . 42
3.3.TẠO DÒNG GEN MÃ HÓA ENZYME TREHALOSE SYNTHASE VÀO
VECTOR pET- 22b . 43
3.3.1. Chèn gen TreS vào pJet1.2 blunt 43
3.3.2. Chèn gen TreS vào pET-22b 44
3.4.BIỂU HIỆN TRÊN E.COLI BL21(DE3) . 49
3.4.1.Chọn lọc dòng . 49
3.4.2. Kết quả Western blot 51
3.4.3. Khảo sát các điều kiện cảm ứng tối ưu . 51
3.4.3.1. Khảo sát chất cảm ứng 52
3.4.3.2 Khảo sát nồng độ chất cảm ứng . 53
3.4.3.3. Khảo sát thời gian cảm ứng . 54
3.4.3.4. Khảo sát vận tốc lắc cảm ứng 55
3.4.3.5. Khảo sát nhiệt độ cảm ứng 56
Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ: . 58
4.1. Kết luận 59
4.2. Kiến nghị 59
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 60
PHỤ LỤC .65