Thạc Sĩ Tạo dòng và biểu hiện các gen mã hóa cho hai enzyme endoglucanase (egi, egii) của Trichoderma reesei

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
Chuyênngành: Vi Sinh Vật Học
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Năm 2012

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Đặc điểm các enzyme cellulase của T. reesei .10
Bảng 2.1. Các mồi sử dụng trong nghiên cứu .28
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR 32
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng nối DNA và plasmid pJET 1.2 33
Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR khuẩn lạc .35
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng cắt bằng enzyme EcoRI và NotI .35
Bảng 2.6. Thành phần gel điện di polyacrylamide 12,5% 43
Bảng 3.1 Kết quả sàng lọc nấm men tái tổ hợp trên môi trường YPD chứa kháng
sinh G418 63
Bảng 3.2 Đường kính vòng phân giải CMC của các chủng Pichia tái tổ hợp .66


DANH MỤC ĐỒ THỊ

Đồ thị 3.1 Nồng độ protein ngoại bào trong môi trường nuôi cấy P. pastoris theo thời gian cảm ứng biểu hiện .67
Đồ thị 3.2 Đường chuẩn thể hiện mối tương quan giữa đường khử glucose và độ hấp thụ OD540nm 70
Đồ thị 3.3 Hoạt tính endoglucanase của EGI, EGII theo thời gian .71



DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Thành phần và cấu trúc lignocelluloses của thực vật 3
Hình 1.2 Mô hình hoạt động của cellulase 5
Hình 1.3. Mô hình tác động của hệ enzyme cellulase trên cellulose 6
Hình 1.4 T. reesei 8
Hình 1.5 Cấu trúc vùng trung tâm xúc tác của EGI .11
Hình 1.6 Mô hình cấu trúc CBD ở EGI của T. reesei .12
Hình 1.7 Mô hình cấu trúc 3D của enzyme EGI và EGII .14
Hình 1.8 Cơ chế thủy phân của cellulase .16
Hình 1.9 Cơ chế trao đổi chéo tại vị trí AOX1 .18
Hình 1.10 Cơ chế trao đổi chéo tại vị trí his4 19
Hình 2.1 Thang chuẩn DNA 23
Hình 2.2 Thang chuẩn protein 24
Hình 2.3. Bản đồ plasmid tạo dòng pJET1.2 25
Hình 2.4. Bản đồ plasmid biểu hiện pPIC9K 26
Hình 2.5. Sơ đồ mô tả quá trình OE-PCR của hai gen mã hóa EGI, EGII 31
Hình 3.1. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại các exon của gen egl1 và egl2 .44
Hình 3.2. Kết quả điện di khuếch đại các DNA đầy đủ của egl1 và egl2 .45
Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm tinh sạch egl1 và egl2 45
Hình 3.4 Cấu trúc plasmid pJET1.2-egl1 và pJET1.2-egl1 48
Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc xác định các dòng E. coli DH5α
mang plasmid pJET1.2-egl1 và pJET1.2-egl2 với cặp mồi pJET-F/pJET-R .49
Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc kiểm tra các dòng E. coli DH5α
mang plasmid pJET1.2-egl1 và pJET1.2-egl2 với các cặp mồi trong 50
Hình 3.7. Điện di phản ứng cắt plasmid pJET1.2-egl1 và pJET1.2-egl2 bằng enzyme cắt EcoRI và NotI .50
Hình 3.8 Cấu trúc plasmid pPIC9K-egl1 và pPIC9K-egl2 58

Hình 3.9. Kết quả điện di PCR khuẩn lạc xác định các dòng E. coli DH5α mang pPIC9K-egl1 và pPIC9K-egl2 với cặp mồi AOX1F/AOX1R 59
Hình 3.10. Điện di sản phẩm cắt giới hạn các plasmid pPIC9K-egl1 và pPIC9K- egl2 bằng enzyme EcoRI/NotI và BspEI 60
Hình 3.11. Kết quả biến nạp plasmid pPIC9K-egl1 và pPIC9K-egl2 vào P. pastoris 62
Hình 3.12 Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự sát nhập của các plasmid
pPIC9K-egl1và pPIC9K-egl2 vào bộ gen P. pastoris GS115 64
Hình 3.13 Vòng phân giải CMC của các dòng P. pastoris tái tổ hợp khi nhuộm với thuốc đỏ Congo 65
Hình 3.14 Điện di SDS-PAGE dịch ngoại bào P. pastoris biểu hiện EGI, EGII .68
Hình 3.15. Điện di SDS-PAGE dịch ngoại bào của P. pastoris tái tổ hợp EGII theo thời gian 69
Hình 3.16 Kết quả xác định hàm lượng protein EGI, EGII trong dịch nuôi cấy P. pastoris tái tổ hợp tại thời điểm 96 giờ .70


ĐẶT VẤN ĐỀ

Nguồn nguyên liệu hóa thạch đang dần cạn kiệt, vấn đề an ninh năng lượng và biến đổi khí hậu là những nguyên nhân chính khiến các nước trên thế giới tìm mọi cách phát triển các nguồn nguyên liệu thay thế, trong đó có nhiên liệu sinh học. Chiến lược phát triển bioethanol từ vật liệu hữu cơ đang được sự quan tâm nghiên cứu của nhiều quốc gia. Tổng sản lượng bioethanol toàn thế giới ngày càng tăng lên, năm 2010 đạt 86,9 tỷ lít, tăng 75% so với năm 2007 (thống kê của RFA, 2011) . Tuy nhiên, công nghệ sản xuất bioethanol hiện nay vẫn chủ yếu từ tinh bột và đường, dẫn đến giá thành sản phẩm tăng cao, đồng thời còn ảnh hưởng đến vấn đề an ninh lương thực. Trong khi đó, lignocellulose từ rơm rạ, bã mía, vỏ bắp, lá khô, mùn cưa, là những phụ phế phẩm nông-lâm nghiệp phổ biến, nếu nguồn nguyên liệu này được tận dụng trong sản xuất bioethanol sẽ mang lại nguồn lợi lớn về mặt kinh tế và góp phần giảm ô nhiễm môi trường.

Điều kiện tiên quyết để sử dụng lignocellulose trong sản xuất ethanol là thu nhận hiệu quả sản phẩm thủy phân glucose từ cellulose, thành phần chính của lignocellulose. Tuy nhiên, nếu sử dụng enzyme để thủy phân cellulose thì chi phí cho giai đoạn này chủ yếu ở khâu sản xuất enzyme cellulase. Do đó, nghiên cứu cải thiện hoạt tính và phương pháp thu nhận enzyme nhằm giảm chi phí sản xuất là điều rất cần thiết.

T. reesei được đánh giá là một trong các sinh vật có khả năng tổng hợp cellulase với hoạt tính cao [23]. Nhưng hiện nay công nghệ sản xuất enzyme cellulase ở nước ta chủ yếu bằng phương pháp nuôi cấy bán rắn nên hiệu quả không cao và khó áp dụng ở quy mô công nghiệp. Ứng dụng những tiến bộ của kỹ thuật di truyền vào sản xuất enzyme cellulase tái tổ hợp là một trong những hướng nghiên cứu tiềm năng để thu nhận enzyme với sản lượng lớn.

Trên cơ sở đó đề tài: ―Tạo dòng và biểu hiện các gen mã hóa cho hai enzyme endoglucanase (EGI, EGII) của Trichoderma reesei trên hệ thống nấm men Pichia pastoris” được tiến hành với mục tiêu nghiên cứu khả năng biểu hiện hai gen egl1 và egl2 của T. reesei trên hệ thống P. pastoris. Đây là hai enzyme endoglucanase quan trọng trong hệ enzyme phân hủy cellulose của T. reesei. Kết quả của đề tài là tiền đề cho các nghiên cứu tạo hỗn hợp enzyme cellulase phân hủy cellulose từ các nguồn phụ phế phẩm nông-lâm nghiệp, từ đó, hướng tới việc sản xuất bioethanol.

Nội dung chính của đề tài bao gồm:

- Thu nhận và tạo dòng các gen mã hóa cho enzyme endoglucanase I (egl1) và endoglucanase II (egl2) từ nấm T. reesei
- Chọn lọc các dòng nấm men P. pastoris mang nhiều bản sao của các gen mã hóa egl1, egl2
- Kiểm tra khả năng biểu hiện và hoạt tính hai enzyme EGI, EGII của các dòng P. pastoris mang gen tái tổ hợp