Thạc Sĩ Tạo dòng và biểu hiện các gen mã hóa cho hai enzyme endoglucanase của Trichoderma reesei trên hệ thố

ĐẶT VẤN ĐỀ

Nguồn nguyên liệu hóa thạch đang dần cạn kiệt, vấn đề an ninh năng lượng và biến đổi khí hậu là những nguyên nhân chính khiến các nước trên thế giới tìm mọi cách phát triển các nguồn nguyên liệu thay thế, trong đó có nhiên liệu sinh học. Chiến lược phát triển bioethanol từ vật liệu hữu cơ đang được sự quan tâm nghiên cứu của nhiều quốc gia. Tổng sản lượng bioethanol toàn thế giới ngày càng tăng lên, năm 2010 đạt 86,9 tỷ lít, tăng 75% so với năm 2007 (thống kê của RFA, 2011) . Tuy nhiên, công nghệ sản xuất bioethanol hiện nay vẫn chủ yếu từ tinh bột và đường, dẫn đến giá thành sản phẩm tăng cao, đồng thời còn ảnh hưởng đến vấn đề an ninh lương thực. Trong khi đó, lignocellulose từ rơm rạ, bã mía, vỏ bắp, lá khô, mùn cưa, là những phụ phế phẩm nông-lâm nghiệp phổ biến, nếu nguồn nguyên liệu này được tận dụng trong sản xuất bioethanol sẽ mang lại nguồn lợi lớn về mặt kinh tế và góp phần giảm ô nhiễm môi trường.
Điều kiện tiên quyết để sử dụng lignocellulose trong sản xuất ethanol là thu nhận hiệu quả sản phẩm thủy phân glucose từ cellulose, thành phần chính của lignocellulose. Tuy nhiên, nếu sử dụng enzyme để thủy phân cellulose thì chi phí cho giai đoạn này chủ yếu ở khâu sản xuất enzyme cellulase. Do đó, nghiên cứu cải thiện hoạt tính và phương pháp thu nhận enzyme nhằm giảm chi phí sản xuất là điều rất cần thiết.
T. reesei được đánh giá là một trong các sinh vật có khả năng tổng hợp cellulase với hoạt tính cao [23]. Nhưng hiện nay công nghệ sản xuất enzyme cellulase ở nước ta chủ yếu bằng phương pháp nuôi cấy bán rắn nên hiệu quả không cao và khó áp dụng ở quy mô công nghiệp. Ứng dụng những tiến bộ của kỹ thuật di truyền vào sản xuất enzyme cellulase tái tổ hợp là một trong những hướng nghiên cứu tiềm năng để thu nhận enzyme với sản lượng lớn.
Trên cơ sở đó đề tài: ―Tạo dòng và biểu hiện các gen mã hóa cho hai enzyme endoglucanase (EGI, EGII) của Trichoderma reesei trên hệ thống nấm men Pichia pastoris” được tiến hành với mục tiêu nghiên cứu khả năng biểu hiện hai gen egl1 và egl2 của T. reesei trên hệ thống P. pastoris. Đây là hai enzyme endoglucanase quan trọng trong hệ enzyme phân hủy cellulose của T. reesei. Kết quả của đề tài là tiền đề cho các nghiên cứu tạo hỗn hợp enzyme cellulase phân hủy cellulose từ các nguồn phụ phế phẩm nông-lâm nghiệp, từ đó, hướng tới việc sản xuất bioethanol.
Nội dung chính của đề tài bao gồm:
- Thu nhận và tạo dòng các gen mã hóa cho enzyme endoglucanase I (egl1) và endoglucanase II (egl2) từ nấm T. reesei
- Chọn lọc các dòng nấm men P. pastoris mang nhiều bản sao của các gen mã hóa egl1, egl2
- Kiểm tra khả năng biểu hiện và hoạt tính hai enzyme EGI, EGII của các dòng P. pastoris mang gen tái tổ hợp

MỤC LỤC

Nội dung Trang
MỤC LỤC i
DANH MỤC VIẾT TẮT .iv
DANH MỤC HÌNH v
DANH MỤC BẢNG vii
DANH MỤC ĐỒ THỊ . viii
ĐẶT VẤN ĐỀ . 1
1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1 Thành phần cellulose của thực vật . 3
1.2 Hệ enzyme phân hủy cellulose 4
1.3 Ứng dụng của enzyme cellulase 6
1.4 Tổng quan về Trichoderma reesei . 7
1.4.1 Vị trí phân loại . 7
1.4.2 Hệ enzyme cellulase của T. reesei . 8
1.4.3 Đặc điểm cấu trúc, chức năng và cơ chế hoạt động của enzyme endoglucanase I (EGI) và endoglucanase II (EGII) . 11
1.4.3.1 Đặc điểm cấu trúc và chức năng 11
1.4.3.2 Cơ chế hoạt động . 14
1.5 Hệ thống biểu hiện protein ở Pichia pastoris 17
1.5.1 Đặc điểm chung của P. pastoris 17
1.5.2 Protein Alcohol Oxidase 17
1.5.3 Tái tổ hợp chuyên biệt vị trí . 18
1.5.4 Biến đổi sau dịch mã 19
1.5.5 Ưu điểm và nhược điểm của hệ thống biểu hiện P. pastoris . 20
1.6 Tình hình nghiên cứu thu nhận enzyme cellulase tái tổ hợp trong và ngoài nước 20
1.6.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới . 20
1.6.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam . 22
2 VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP 23
2.1 Vật liệu . 23
2.2 Phương pháp 29
2.2.1 Quy trình tạo dòng tế bào P. pastoris có khả năng biểu hiện hai enzyme endoglucanase I và endoglucanase II từ T. reesei 29
2.2.2 Thu nhận các DNA mã hóa các enzyme endoglucanase I, endoglucanase II từ T. reesei 29
2.2.3 Tạo dòng các gen mã hóa enzyme EGI, EGII trong tế bào E. coli DH5α . 33
2.2.4 Tạo dòng tế bào P. pastoris biểu hiện các gen mã hóa enzyme endoglucanase I và endoglucanase II của T. reesei . 36
2.2.4.1 Tạo dòng E. coli DH5α mang vector biểu hiện pPIC9K chứa các gen egl1, egl2 của T. reesei . 36
2.2.4.2 Tạo dòng P. pastoris mang gen egl1 và egl2 . 37
2.2.4.3 Chọn lọc các dòng P. pastoris mang nhiều bản sao của các gen egl1 và egl2 và có khả năng năng tiết ngoại bào các enzyme EGI, EGII 39
2.2.4.4 Kiểm tra khả năng biểu hiện và hoạt tính xúc tác của các enzyme EGI, EGII tái tổ hợp trong P. pastoris . 40
3 KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN . 44
3.1 Thu nhận các DNA mã hóa enzyme endoglucanase I và endoglucanase II từ T. reesei 44
3.2 Tạo dòng các gen mã hóa hai enzyme EGI, EGII trong tế bào E. coli DH5α 46
3.2.1 Sàng lọc các dòng E. coli DH5α mang gen egl1 và egl2 bằng phương pháp PCR khuẩn lạc 46
3.2.2 Kiểm tra các dòng E. coli DH5α mang gen egl1 và egl2 bằng enzyme cắt giới hạn . 50
3.2.3 Kiểm tra các dòng E. coli DH5α mang DNA tái tổ hợp bằng giải trình tự nucleotide . 51
3.2.3.1 Tạo dòng E. coli DH5α mang vector biểu hiện pPIC9K chứa các gen eg11, egl2 của T. reesei . 56
3.2.3.2 Tạo dòng P. pastoris mang gen eg11 và egl2 62
3.2.3.3 Chọn lọc các dòng P. pastoris GS115 mang nhiều bản sao các gen egl1 và egl2 có khả năng tiết ngoại bào các enxyme EGI, EGII 63
3.2.4 Kiểm tra khả năng biểu hiện của các enzyme EGI, EGII tái tổ hợp trong môi trường nuôi cấy P. pastoris . 66
4 KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ . 69
4.1 Kết luận 69
4.2 Đề nghị . 69
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 71