Tiến Sĩ Tạo dòng chịu hạn và phân lập gen Cystatin liên quan đến tính chịu hạn ở cây Lạc (Arachis hypogaea L

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
NĂM 2011


MỤC LỤC
Trang
Lời cam đoan i
Lời cảm ơn ii
Mục lục iii
Danh mục các ký hiệu, chữ viết tắt vi
Danh mục bảng viii
Danh mục hình x
MỞ ĐẦU . 1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1. Cây lạc và đặc tính chịu hạn của cây lạc . 4
1.1.1. Nguồn gốc và đặc điểm nông sinh học của cây lạc . 4
1.1.2. Đặc tính chịu hạn của thực vật và của cây lạc . 8
1.2. Nghiên cứu nâng cao khả năng chịu hạn của cây trồng bằng công
nghệ tế bào thực vật . 15
1.2.1. Chọn dòng tế bào soma trong chọn giống cây trồng 16
1.2.2. Phát sinh biến dị trong quá trình nuôi cấy . 19
1.2.3. Các phương pháp chọn dòng tế bào . 20
1.2.4. Một số thành tựu trong chọn dòng chống chịu yếu tố bất lợi của
ngoại cảnh . 21
1.3. Phân tích, đánh giá các dòng chọn lọc có nguồn gốc từ nuôi cấy
mô sẹo 23
1.3.1. Đánh giá khả năng chịu mất nước của mô, tế bào thực vật . 23
1.3.2. Đánh giá khả năng chịu hạn ở giai đoạn hạt nảy mầm và giai đoạn
cây non 24
1.3.3. Kỹ thuật RAPD trong đánh giá hệ gen của các dòng chọn lọc 26
1.4. Gen liên quan đến tính chịu hạn ở cây lạc 28
1.4.1. Các gen liên quan đến khả năng chịu hạn của cây lạc . 28
1.4.2. Nhóm gen mã hóa protein điều khiển hoạt động phiên mã của các
gen chịu hạn . 29
1. 5. Cystatin và vai trò của cystatin ở thực vật 30
1.5.1 Đặc điểm cấu tạo và phân loại cystatin 30
1.5.2. Cấu trúc không gian và cơ chế ức chế của cystatin . 33
1.5.3. Chức năng của cystatin . 37
1.5.4. Gen mã hóa cystatin . 38

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . . 43
2.1. Vật liệu thực vật 43
2.2. Hoá chất và thiết bị . 45
2.3. Phương pháp nghiên cứu . 45
2.3.1. Phương pháp nuôi cấy in vitro . 46
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu đồng ruộng 49
2.3.3. Phương pháp sinh lý, hoá sinh . 50
2.3.4. Phương pháp sinh học phân tử . 52
2.3.5. Phương pháp phân tích số liệu . 55
2.4. Địa điểm nghiên cứu . 56

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN . 57
31. Kết quả tạo dòng chịu hạn bằng kỹ thuật xử lý mô sẹo trong hệ
thống nuôi cấy in vitro . 57
3.1.1 Sàng lọc dòng mô sẹo chịu tác động của thổi khô 57
3.1.2 Ảnh hưởng của tia gamma kết hợp với thổi khô đến tỷ lệ sống sót
và tái sinh cây của giống lạc L18 . 66
3.1.3 Đặc điểm nông sinh học của các quần thể lạc ở thế hệ R0 và RM0 . 69
3.2. Kết quả phân tích những dòng lạc chọn lọc qua các thế hệ . 74
3.2.1. Đặc điểm nông sinh học các dòng lạc chọn lọc ở thế hệ thứ Nhất
và thứ Ba 74
3.2.2. Đánh giá các dòng chọn lọc ở thế hệ thứ Năm . 78
3.2.3. Đặc điểm của một số dòng lạc ưu việt . 94
3.3. Phân lập và xác định trình tự gen cystatin từ cây lạc 97
3.3.1. Khuyếch đại gen cystatin từ DNA hệ gen của cây lạc . 97
3.3.2. Kết quả tách dòng và xác định trình tự gen cystatin . 98
3.3.3. Kết quả so sánh trình tự gen và protein cystatin 102
KẾT LUẬN . 111
CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 113
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 114
PHỤ LỤC

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Lạc (Arachis hypogaea L.) là cây thực phẩm, cây công nghiệp lấy dầu
trong nhóm cây trồng cạn. Mặc dù cây lạc đã có từ lâu đời nhưng vai trò của
cây lạc mới được công bố từ khoảng 100 năm trở lại đây. Trồng lạc mang lại
nguồn lợi có giá trị về kinh tế, về dinh dưỡng, đồng thời còn để cải tạo đất rất
tốt nhờ khả năng cộng sinh với vi khuẩn Rhizobium [3]. Trên thế giới, nhu
cầu sử dụng và tiêu thụ lạc ngày càng tăng, đó cũng là lý do khuyến khích
nhiều nước đầu tư phát triển sản xuất lạc với quy mô liên tục mở rộng [145].
Ở Việt Nam, sản xuất lạc được phân bố trên tất cả các vùng sinh thái
nông nghiệp, với khoảng 40% tổng diện tích gieo trồng các cây công nghiệp
ngắn ngày. Trong đó, 2/3 diện tích đất trồng lạc phụ thuộc vào nước trời. So
với nhiều cây trồng khác, cây lạc có nhu cầu đặc biệt về nước bởi rễ không có
lông hút và quả lạc được hình thành dưới đất. Sự biến đổi khí hậu làm cho
lượng mưa hàng năm phân bố không đều giữa các vùng miền và các thời điểm
trong năm. Trong khi đó, quá trình sinh trưởng và phát triển của cây lạc có
những giai đoạn rất mẫn cảm với độ ẩm, nếu những giai đoạn này thiếu nước
sẽ làm giảm năng suất, chất lượng của lạc. Chính vì vậy, việc đánh giá để có
biện pháp cải tạo giống lạc theo hướng nâng cao khả năng chịu hạn là rất cần
thiết.
Các phương pháp đã và đang được nghiên cứu ứng dụng để cải tạo, phát
huy tiềm năng của nhiều loại cây trồng như: lai giống, đột biến thực nghiệm,
công nghệ tế bào thực vật và chuyển gen [30], [76], [131]. Hiệu quả việc
ứng dụng công nghệ tế bào thực vật để nâng cao tính chống chịu bất lợi môi
trường liên tục được khẳng định. Trong quá trình nuôi cấy in vitro do ảnh
hưởng của môi trường, đặc biệt là chất kích thích sinh trưởng, các tế bào có
thể bị biến đổi vật chất di truyền. Larkin và Scowcroft (1981) gọi những biến
dị đó là “biến dị soma” hay “biến dị sinh dưỡng”. Nếu kết hợp nuôi cấy mô tế
bào với xử lý đột biến bằng các tác nhân vật lý hay hoá học thì tần số đột biến
có thể tăng thêm [85]. Điều này có ý nghĩa đặc biệt quan trọng trong việc tạo
ra nguồn vật liệu khởi đầu cho chọn giống [87]. Ở Việt Nam, sự ra đời của 2
giống lúa DR1 và DR2 có khả năng chịu hạn và chịu lạnh tốt là minh chứng
đầu tiên cho những khả năng đó [1]. Đến nay, nhiều dòng cây có nguồn gốc in
vitro mang tính trạng mong muốn được tạo ra từ quá trình xử lý và nuôi cấy
mô sẹo đã được công bố [6], [34], [39], [130].
Khả năng chịu hạn của thực vật là tính trạng do nhiều gen quy định. Do
vậy, việc tìm kiếm và phân tích gen liên quan đến đặc tính chịu hạn được
nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu. Một số gen liên quan đến tính chịu
hạn của cây trồng đã được phân lập và công bố như: gen LEA [32]; gen DREB
[113]; gen P5CS [10]; gen NCED, AhPLD [104], [128] . Gen cystatin (CYS)
của thực vật được công bố đầu tiên trên cây lúa bởi Abe và đtg (1987) [40].
Đến nay, gen CYS được phân lập ở nhiều loài thực vật bậc cao, cây một lá
mầm và hai lá mầm [17], [92], [95] . Các nghiên cứu về gen cystatin bàn luận
nhiều về mối liên quan của nó với khả năng chống chịu hạn, lạnh, mặn [52],
[57], [96], [125] .
Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn của việc chọn tạo giống lạc theo hướng
nâng cao khả năng chịu hạn, chúng tôi đã tiến hành đề tài của luận án: “Tạo
dòng chịu hạn và phân lập gen cystatin liên quan đến tính chịu hạn ở cây
lạc (Arachis hypogaea L.)”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Tạo được dòng lạc có khả năng chịu hạn cao hơn giống gốc bằng công
nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật.
- Xác định được sự khác biệt trong trình tự của gen cystatin giữa dòng lạc
chọn lọc có nguồn gốc từ mô sẹo và các giống lạc có khả năng chịu hạn
khác nhau.