Thạc Sĩ Tạo dòng chịu hạn và phân lập gen Cystatin liên quan đến tính chịu hạn ở cây lạc (Arachis hypogaea L

MỤC LỤC
Trang
Lời cam đoan i
Lời cảm ơn ii
Mục lục iii
Danh mục các ký hiệu, chữ viết tắt vi
Danh mục bảng viii
Danh mục hình x
MỞ ĐẦU . 1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1. Cây lạc và đặc tính chịu hạn của cây lạc . 4
1.1.1. Nguồn gốc và đặc điểm nông sinh học của cây lạc . 4
1.1.2. Đặc tính chịu hạn của thực vật và của cây lạc . 8
1.2. Nghiên cứu nâng cao khả năng chịu hạn của cây trồng bằng công
nghệ tế bào thực vật . 15
1.2.1. Chọn dòng tế bào soma trong chọn giống cây trồng 16
1.2.2. Phát sinh biến dị trong quá trình nuôi cấy . 19
1.2.3. Các phương pháp chọn dòng tế bào . 20
1.2.4. Một số thành tựu trong chọn dòng chống chịu yếu tố bất lợi của
ngoại cảnh . 21
1.3. Phân tích, đánh giá các dòng chọn lọc có nguồn gốc từ nuôi cấy
mô sẹo 23
1.3.1. Đánh giá khả năng chịu mất nước của mô, tế bào thực vật . 23
1.3.2. Đánh giá khả năng chịu hạn ở giai đoạn hạt nảy mầm và giai đoạn
cây non 24
1.3.3. Kỹ thuật RAPD trong đánh giá hệ gen của các dòng chọn lọc 26
1.4. Gen liên quan đến tính chịu hạn ở cây lạc 28

1.4.1. Các gen liên quan đến khả năng chịu hạn của cây lạc . 28
1.4.2. Nhóm gen mã hóa protein điều khiển hoạt động phiên mã của các
gen chịu hạn . 29
1. 5. Cystatin và vai trò của cystatin ở thực vật 30
1.5.1 Đặc điểm cấu tạo và phân loại cystatin 30
1.5.2. Cấu trúc không gian và cơ chế ức chế của cystatin . 33
1.5.3. Chức năng của cystatin . 37
1.5.4. Gen mã hóa cystatin . 38
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 43
2.1. Vật liệu thực vật 43
2.2. Hoá chất và thiết bị . 45
2.3. Phương pháp nghiên cứu . 45
2.3.1. Phương pháp nuôi cấy in vitro . 46
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu đồng ruộng 49
2.3.3. Phương pháp sinh lý, hoá sinh . 50
2.3.4. Phương pháp sinh học phân tử . 52
2.3.5. Phương pháp phân tích số liệu . 55
2.4. Địa điểm nghiên cứu . 56
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN . 57
31. Kết quả tạo dòng chịu hạn bằng kỹ thuật xử lý mô sẹo trong hệ
thống nuôi cấy in vitro . 57
3.1.1 Sàng lọc dòng mô sẹo chịu tác động của thổi khô 57
3.1.2 Ảnh hưởng của tia gamma kết hợp với thổi khô đến tỷ lệ sống sót
và tái sinh cây của giống lạc L18 . 66
3.1.3 Đặc điểm nông sinh học của các quần thể lạc ở thế hệ R0 và RM0 . 69
3.2. Kết quả phân tích những dòng lạc chọn lọc qua các thế hệ . 74
3.2.1. Đặc điểm nông sinh học các dòng lạc chọn lọc ở thế hệ thứ Nhất
và thứ Ba 74

v
3.2.2. Đánh giá các dòng chọn lọc ở thế hệ thứ Năm . 78
3.2.3. Đặc điểm của một số dòng lạc ưu việt . 94
3.3. Phân lập và xác định trình tự gen cystatin từ cây lạc 97
3.3.1. Khuyếch đại gen cystatin từ DNA hệ gen của cây lạc . 97
3.3.2. Kết quả tách dòng và xác định trình tự gen cystatin . 98
3.3.3. Kết quả so sánh trình tự gen và protein cystatin 102
KẾT LUẬN . 111
CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 113
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 114
PHỤ LỤC

vi
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
ABA : absicis acid
AhNCED : Arachis hypogaea 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase
AhSP : Arachis hypogaea serine proteinase
BAP : 6 Benzyl amino purin
bp : base pair
CC : Corn Cystatin
CKH : Cây không héo
CTAB : Cetyltrimethylammonium bromide
CYS : cystatin
DNA : Deoxyribose nucleic acid
đtg : đồng tác giả
EDTA : Ethylene diamine tetraacetic acid
CHP : Cây hồi phục
HSP : heat shock protein
HvCPI : Hodeum vulgare Cysteine Proteinase Inhibitor
IPTG : Isopropyl b-D-1 thiogalactopyranoside
kb : kilo base
kDa : kilo dalton
KLK : Khối lượng khô
krad : kilorad
LB : Luria- Bertani
LEA : late embryogenesis abudant
LTPs : lipid transfer proteins
MS : Murashige- Skoog
mRNA : messenger Ribonucleic acid
Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn
Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn
vii
OC : Oryza Cystatin
OD : Optical Density
PCR : Polymerase chain reaction
PEG : Polyethylene glycol
PLDa : Phospholipase Da
RAPD : Random amplified polymorphic DNA
SDS : Sodium Dodesyl Sulphate
TAE : Tris Acetate EDTA
TTC : 2,3,5 Trichlo tetrazolium chlorit
VuC : Vigna unguiculata cystatin
X-gal : 5- Bromo- 4 Cloro- 3 indolyl D galactopyranoside
WC :Wheat cystatin
2,4D : 2.4 Dichlorphenoxyacetic acid
α- NAA : α- Naphthaleneacetic acid

viii
DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Diện tích, năng suất và sản lượng lạc của Việt Nam giai
đoạn 2005-2009 5
Bảng 1.2. Gen cystatin liên quan với khả năng chống chịu hạn ở
một số loài thực vật . 41
Bảng 2.1. Một số đặc điểm của 10 giống lạc nghiên cứu 43
Bảng 3.1. Tỷ lệ tạo mô sẹo và khối lượng mô sẹo của 10 giống lạc 58
Bảng 3.2. Độ mất nước của mô sẹo sau xử lý bằng kỹ thuật thổi khô 59
Bảng 3.3. Kết quả kiểm tra khả năng chịu mất nước của mô sẹo 10
giống lạc bằng phương pháp nhuộm TTC 61
Bảng 3.4. Tỷ lệ sống sót của mô sẹo bị xử lý bằng thổi khô sau 4
tuần nuôi phục hồi 63
Bảng 3.5. Tỷ lệ tái sinh cây của mô sẹo sống sót sau 6 tuần 65
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của chiếu xạ kết hợp với thổi khô 9 giờ đến
tỷ lệ sống sót và tái sinh cây của mô sẹo ở giống lạc L18 66
Bảng 3.7. Đặc điểm nông học của quần thể R0, RM0 tái sinh từ mô
sẹo mất nước 70
Bảng 3.8. Đặc điểm nông sinh học các dòng lạc chọn lọc ở thế hệ
thứ Nhất . 75
Bảng 3.9. Đặc điểm nông học các dòng lạc chọn lọc thế hệ thứ Ba 77
Bảng 3.10. Đặc điểm nông sinh học và chất lượng hạt các dòng
chọn lọc ở thế hệ thứ Năm . 79
Bảng 3.11. Tương quan giữa hoạt độ của a-amylase và hàm lượng
đường ở giai đoạn hạt nảy mầm . 84
Bảng 3.12. Tỷ lệ cây sống, cây phục hồi và chỉ số chịu hạn tương
đối của các dòng chọn lọc ở thế hệ thứ Năm 86

ix
Bảng 3.13. Số phân đoạn DNA nhân bản ngẫu nhiên và tỷ lệ phân
đoạn đa hình của 25 mồi trong phản ứng RAPD . 90
Bảng 3.14. Tỷ lệ sai khác về hệ gen của các dòng chọn lọc và giống
gốc L18 . 91
Bảng 3.15. Chỉ thị RAPD đặc trưng của các dòng lạc chọn lọc 93
Bảng 3.16. Một số đặc điểm của 3 dòng chọn lọc và giống L18 95
Bảng 3.17. Sựsai khác về trình tự nucleotide trên gen cystatin của
giống và dòng lạc nghiên cứu . 103
Bảng 3.18. Độ tương đồng và độ sai khác đoạn mã hoá một số trình
tự gen cystatin . 104
Bảng 3.19. Thành phần amino acid của protein cystatin ở cây lạc 109

DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Trình tự 102 amino acid của OCI 32
Hình 1.2. Cấu trúc không gian ba chiều của cystatin thực vật 34
Hình 1.3. Mô hình cấu trúc ức chế hoạt động của oryzacystatin . 36
Hình 2.1. Mô hình thí nghiệm tổng quát . 46
Hình 3.1. Độ mất nước của mô sẹo các giống lạc . 60
Hình 3.2. Dung dịch nhuộm TTC của mô sẹo giống lạc L18 ở các
ngưỡng xử lý thổi khô . 62
Hình 3.3. Một số hình ảnh cây tái sinh của giống lạc L18 ở giai đoạn
6 tuần tuổi 68
Hình 3.4. Các dòng lạc chọn lọc trồng ở vụ xuân 2008 70
Hình 3.5. Hình ảnh trong chọn dòng chịu hạn ở lạc bằng kỹ thuật
nuôi cấy in vitro
72
Hình 3.6. Sự biến động về hoạt độ của a-amylase trong điều kiện
hạn sinh lý 81
Hình 3.7 Sự biến động hàm lượng đường trong điều kiện hạn sinh lý 83
Hình 3.8 Đồ thị hình rada biểu thị sự khác nhau về khả năng chịu
hạn của các dòng lạc chọn lọc, giống L18 và giống L23 87
Hình 3.9. Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với một số mồi 89
Hình 3.10. Sơđồ mô tả mối quan hệ của 7 dòng chọn lọc với giống
gốc L18 ở mức phân tử 92
Hình 3.11. Hình ảnh quả và hạt của các dòng chọn lọc ở thế hệ thứ
Năm . . 96
Hình 3.12. Hình ảnh điện di sản phẩm nhân gen cystatin từ cây lạc . 97

xi
Hình 3.13. Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR . 99
Hình 3.14. Kết quả so sánh trình tự nucleotide gen cystatin của cây lạc 102
Hình 3.15. Mối quan hệ di truyền của một số đoạn mã hoá gen
cystatin thực vật . 105
Hình 3.16. So sánh trình tự amino acid của 4 mẫu nghiên cứu . 107