Thạc Sĩ Tạo dòng, biểu hiện và tinh sạch protein IFN-γ người trong hệ thống biểu hiện E. coli ở quy mô phòng

LỜI MỞ ĐẦU

Gan là một trong những cơ quan đóng vai trò sống còn của cơ thể, nó có tác dụng giải độc, lọc máu, có khả năng dự trữ và sản sinh các chất dinh dưỡng quan trọng Một trong những bệnh lý nguy hiểm của gan là xơ gan. Xơ gan làm gan không thực hiện được chức năng bình thường, là bệnh mạn tính và có nhiều biến chứng, do đó nó rất nguy hiểm và có nguy cơ tử vong cao. Hiện nay tại Việt Nam có khoảng 10 triệu người bị xơ gan và số bệnh nhân ngày càng tăng theo từng năm. Có nhiều nguyên nhân dẫn tới xơ gan trong đó có hai nguyên nhân đứng đầu là nghiện rượu thời gian dài và bị nhiễm virut viêm gan Tình hình xơ gan hiện nay đang có xu hướng gia tăng, nguyên nhân chủ yếu là do số người bị nhiễm virut viêm gan tăng cao. Do đó các bệnh nhân cần chữa trị ngày càng nhiều. Các tổn thương về gan do xơ gan không hồi phục được, các phương pháp điều trị thường chỉ có thể giúp ngăn ngừa tổn thương thêm và làm giảm biến chứng. Cách điều trị tốt nhất là tùy thuộc vào nguyên nhân xơ gan. Các nghiên cứu đã cho thấy, việc điều trị xơ gan bằng protein IFN-γ có nhiều ưu điểm hơn so với các loại thuốc khác đang được sử dụng như: có khả năng điều biến miễn dịch, ít gây tác dụng phụ, không gây độc cho người
Protein IFN-γ là một cytokine được tổng hợp từ một đoạn mRNA dài khoảng 1,2 Kb tạo thành một chuỗi polypeptide chứa khoảng 166 axit amin, đóng vai trò quan trọng trong điều trị các bệnh như: xơ gan, ung thư hay các bệnh về virut .Cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học, đặc biệt là công nghệ protein tái tổ hợp, ngày nay quá trình sản xuất IFN-γ cũng đã bắt đầu được nghiên cứu tại một số nước trên thế giới. Tuy nhiên, tại châu Á nói chung và Việt Nam nói riêng, những nghiên cứu về protein IFN-γ còn rất hạn chế. Tại Việt Nam, công ty CNSH Dược Nanogen là công ty chuyên sản xuất các chế phẩm sinh học từ protein tái tổ hợp và đã thành công với các chế phẩm như: Feronsure, Pegnano, Nanokine phục vụ nhu cầu điều trị bệnh của người dân. Hướng nghiên cứu tiếp theo của công ty là sản xuất ra các chế phẩm có khả năng điều trị xơ gan đang có xu hướng gia tăng tại Việt Nam. Với mục đích sản xuất protein IFN-γ phục vụ nhu cầu nghiên cứu và điều trị bệnh, chúng tôi chọn đề tài: “Tạo dòng, biểu hiện và tinh sạch protein IFN-γ người trong hệ thống biểu hiện E. coli ở quy mô phòng thí nghiệm”. Đề tài thực hiện một số nội dung sau:
- Tạo vector tái tổ hợp mang gen sinh tổng hợp protein IFN-γ.
- Tạo ngân hàng chủng gốc và chủng sản xuất mang vector tái tổ hợp có khả năng biểu hiện protein IFN-γ.
- Tối ưu hóa điều kiện lên men sinh tổng hợp protein IFN-γ ở quy mô phòng thí nghiệm.
- Protein IFN-γ sau khi được tổng hợp trong quá trình lên men sẽ được tinh sạch bằng phương pháp sắc ký FPLC và kiểm tra độ tinh sạch bằng phương pháp HPLC.

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT . i
DANH MỤC CÁC BẢNG iii
DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ iv
LỜI MỞ ĐẦU . vi
1.1 Giới thiệu chung về IFN 1
1.1.1 Lịch sử phát hiện . 1
1.1.2 Đặc điểm chung . 2
1.1.3 Phân loại và nguồn gốc 4
1.2 Interferon gamma (IFN-γ) . 6
1.2.1 Cấu trúc protein IFN-γ . 6
1.2.2 Sự tạo thành protein IFN-γ . 7
1.2.3 Cấu trúc thụ thể và con đường truyền tín hiệu của protein IFN-γ . 8
1.2.3.1Cấu trúc thụ thể của IFN-γ 8
1.2.3.2Con đường truyền tín hiệu của protein IFN-γ . 10
1.3 Ứng dụng điều trị xơ gan và những tác động của protein IFN-γ 12
1.3.1 Ứng dụng điều trị xơ gan của protein IFN-γ . 12
1.3.2 Những tác động của protein IFN-γ trong điều trị bệnh . 14
1.4 Biểu hiện protein tái tổ hợp dạng thể vùi trong tế bào vi khuẩn E. coli . 19
1.4.1 Ưu điểm biểu hiện protein tái tổ hợp trong tế bào E. coli . 19
1.4.2 Sự hình thành thể vùi trong tế bào chất E. coli . 20
1.4.3 Chủng E. coli, hệ thống vector và cơ chế kiểm soát được dùng trong biểu hiện protein . 20
1.4.3.1 Chủng E. coli BL21(DE3) Star 20
1.4.3.2 Hệ thống vector biểu hiện protein tái tổ hợp dạng thể vùi sử dụng promoter T7 21
2.1 Vật liệu 25
2.1.1 Chủng vi sinh vật . 25
2.1.2 Vector 25
2.1.3 Gen IFN-γ 26
2.1.4 Các mồi dùng cho giải trình tự . 26
2.1.5 Các thang chuẩn dùng cho điện di 27
2.1.6 Các kháng thể dùng cho lai Western blot . 27
2.2 Hóa chất . 27
2.2.1 Hóa chất dùng cho điện di DNA 27
2.2.2 Hóa chất dùng cho phản ứng cắt 28
2.2.3 Hóa chất dùng cho phản ứng PCR 28
2.2.4 Hóa chất dùng tinh sạch DNA từ gel Agarose 28
2.2.5 Hóa chất dùng biến nạp plasmid 28
2.2.6 Hóa chất dùng cho điện di protein 28
2.2.7 Hóa chất dùng cho western blot . 28
2.2.8 Hóa chất dùng biểu hiện protein mục tiêu 29
2.2.9 Hóa chất dùng cho ELISA . 29
2.2.10 Hóa chất dùng hòa tan IFN-γ từ tế bào E. coli 29
2.2.11 Hóa chất dùng cho tinh chế protein tái tổ hợp 30
2.3 Dụng cụ và thiết bị . 30
2.4 Phương pháp 30
2.4.1 Chuẩn bị tế bào khả nạp . 30
2.4.2 Hóa biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E. coli khả nạp 31
2.4.3 Cắt mở vòng vector pNanogen bởi cặp enzyme NdeI/HindIII 31
2.4.4 Tạo vector tái tổ hợp pNanogenIFN-γ 31
2.4.5 PCR khuẩn lạc . 32
2.4.6 Quy trình nuôi cấy chủng E. coli BL21(DE3) Star/pNanogenIFN-γ sinh tổng hợp protein IFN-γ ở quy mô phòng thí nghiệm . 33
2.4.7 Phương pháp điện di SDS-PAGE . 34
2.4.8 Phương pháp lai western blot . 34
2.4.9 Phương pháp ELISA 35
2.4.10 Thu nhận protein IFN-γ từ tế bào E. coli 36
2.4.11 Tinh sạch protein IFN-γ . 37
2.4.12 Sắc ký HPLC . 39
2.5 Sơ đồ tóm tắt toàn bộ quy trình thực hiện các thí nghiệm . 40
2.5.1 Quy trình tạo dòng E. coli biểu hiện protein IFN-γ . 40
2.5.2 Quy trình lên men thu nhận protein IFN-γ 41
2.5.3 Quy trình tinh chế thu nhận protein IFN-γ 42
3.1 Tạo dòng vi khuẩn E. coli biểu hiện protein IFN-γ . 43
3.1.1 Thu nhận gen IFN-γ . 43
3.1.2 Tạo dòng vector tái tổ hợp mang gen IFN-γ . 44
3.1.3 Tạo dòng E. coli BL21(DE3) Star/pNanogenIFN-γ biểu hiện protein IFN-γ 46
3.1.4 Xây dựng đường cong tăng trưởng chủng E. coli BL21(DE3) Star/ pNanogenIFN-γ trên môi trường LB . 47
3.2 Tối ưu hóa điều kiện lên men biểu hiện protein IFN-γ 48
3.2.1 Khảo sát thời điểm cảm ứng biểu hiện IFN-γ . 48
3.2.2 Khảo sát nồng độ IPTG 50
3.2.3 Khảo sát nhiệt độ nuôi cấy trong quá trình cảm ứng . 51
3.2.4 Khảo sát thời gian nuôi cấy sau cảm ứng ảnh hưởng đến sự biểu hiện protein IFN-γ 53
3.3 Nuôi cấy chủng E. coli BL21(DE3) Star/pNanogenIFN-γ biểu hiện protein IFN-γ trên môi trường LB ở quy mô 500 ml trong điều kiện tối ưu . 54
3.4 Tinh sạch protein IFN-γ . 55
3.4.1 Tách chiết protein IFN-γ 55
3.4.2 Tinh sạch protein IFN-γ . 56
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 63
TÀI LIỆU THAM KHẢO 64
DANH MỤC CÁC BẢNG PHỤ LỤC 74