Thạc Sĩ Tạo dòng, biểu hiện và tinh chế hFGF-2 (human fibroblast growth factor 2) tái tổ hợp từ Escherichia

LỜI MỞ ĐẦU
Nhân tố tăng trưởng nguyên bào sợi FGF-2 (Fibroblast Growth Factor-2) là một protein đa chức năng, tham gia điều hòa hoạt động của nhiều quá trình trong cơ thể như cân bằng nội mô, duy trì và tăng sinh tế bào thần kinh, chữa lành xương bị tổn thương, kích thích hình thành tế bào bạch cầu và sự hình thành mạch máu mới từ mạch máu sẵn có, kích thích sự tăng trưởng của tế bào cơ mềm, ngăn chặn quá trình xơ hóa ở phổi, chữa lành vết thương và sửa chữa mô
Do sự đa dạng về chức năng, FGF-2 đang được quan tâm nghiên cứu để ứng dụng trong nhiều lĩnh vực. Nhờ khả năng kích thích tăng sinh, ức chế biệt hóa, FGF-2 đang được sử dụng như là thành phần không thể thiếu trong nuôi cấy tế bào gốc phôi người. Trong công nghệ mỹ phẩm, một số nghiên cứu cho thấy FGF-2 có khả năng làm đen tóc, ngăn ngừa sự lão hóa da nên ngày càng được các hãng mỹ phẩm tin tưởng và bổ sung vào các bộ sản phẩm chăm sóc da, tóc. Bên cạnh đó, trong lĩnh vực y học, việc sử dụng FGF-2 đã đem lại nhiều kết quả khả quan trong việc điều trị nhiều căn bệnh như bệnh thiếu máu tim cục bộ, điều trị bỏng, ngăn ngừa sẹo lồi do phẫu thuật, chữa bệnh viêm nha chu
Trước đây, sản phẩm FGF-2 thường được thu nhận bằng cách tách chiết từ các dòng tế bào động vật. Việc sản xuất FGF-2 bằng phương pháp này đảm bảo về hoạt tính của sản phẩm nhưng sản lượng thấp và giá thành cao. Nhằm khắc phục những nhược điểm trên, người ta đã tiến đến việc ứng dụng công nghệ DNA tái tổ để sản xuất nhân tố FGF-2. Do đặc điểm của FGF-2 là không có cấu nối disulfide nội phân tử và không cần sự biến đổi sau dịch mã cho hoạt tính sinh học nên hệ thống chủng chủ E.coli có thể đảm nhiệm việc sản xuất FGF-2 có hoạt tính thay cho các dòng tế bào động vật.
Ở Việt Nam, FGF-2 chủ yếu được nhập từ các công ty nước ngoài nên giá thành rất cao (1mg protein FGF-2 người được sản xuất nhờ kĩ thuật gen có giá khoảng 1260
- 2 -
Luận văn thạc sĩ sinh học
USD, hãng ProSpec) gây khó khăn trong việc ứng dụng. Do đó, việc sản xuất FGF-2 trong nước nhằm đáp ứng nhu cầu sử dụng trên diện rộng với giá thành thấp cần được quan tâm đầu tư.
Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành đề tài “Tạo dòng, biểu hiện và tinh chế hFGF-2 (human fibroblast growth factor 2) tái tổ hợp từ Escherichia coli” như là bước đầu để nghiên cứu, sản xuất FGF-2 hiệu quả, kinh tế cho những ứng dụng trong nước. Tuy nhiên, một trong những hạn chế của việc sử dụng E. coli làm tế bào chủ là protein thường được tạo ra dưới dạng thể vùi không có hoạt tính, cần phải trải qua quá trình gấp cuộn phức tạp, tốn kém. Do vậy, luận văn này được thực hiện với mục đích xây dựng quy trình sản xuất FGF-2 trong đó sử dụng chủng chủ E. coli để cảm ứng biểu hiện protein dạng tan trong tế bào chất. Đây là hướng chiến lược hiệu quả và triển vọng cho phép sản xuất FGF-2 có hoạt tính một cách đơn giản với hiệu suất cao, giúp hạ giá thành sản phẩm.
Với mục tiêu trên, chúng tôi thực hiện luận văn với những nội dung sau:
- Tạo dòng vi khuẩn E. coli DH5α mang vector pET-fgf2.
- Tạo dòng vi khuẩn E. coli BL21(DE3) mang vector pET-fgf2 có khả năng biểu hiện rhFGF-2 trong tế bào chất.
- Tiến hành lên men và thu nhận được protein rhFGF-2 từ 1L dịch lên men, đánh giá hiệu quả lên men.
- Tinh chế protein rhFGF-2 từ dịch lên men bằng sắc ký trao đồi ion và sắc kí ái lực; đánh giá độ tinh sạch và hiệu suất của quá trình tinh chế.

MỤC LỤC
MỤC LỤC .i
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v
DANH MỤC HÌNH vii
DANH MỤC BẢNG .ix
LỜI MỞ ĐẦU .1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3
1.1. HỌ NHÂN TỐ TĂNG TRƯỞNG NGUYÊN BÀO SỢI FGF (FIBROBLAST GROWTH FACTOR) .4
1.1.1. Giới thiệu chung 4
1.1.2. Nhân tố tăng trưởng FGF-2 .7
1.1.2.1. Cấu trúc của nhân tố tăng trưởng FGF-2 .7
1.1.2.2. Hoạt tính sinh học của FGF-2 .12
1.1.2.3. Các hướng ứng dụng của FGF-2 13
1.2. BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP Ở Escherichia coli 16
1.2.1. Giới thiệu chung 16
1.2.2. Các vị trí biểu hiện protein tái tổ hợp .18
1.2.2.1. Biểu hiện ở tế bào chất .18
1.2.2.2. Biểu hiện ở chu chất .18
1.2.2.3. Tiết ra môi trường 19
1.2.3. Một số hệ thống cảm ứng biểu hiện ở E. coli .19
1.2.3.1. Hệ thống cảm ứng bởi IPTG 19
1.2.3.2. Hệ thống cảm ứng bởi L – arabinose .22
1.2.3.3. Hệ thống cảm ứng bởi muối .22
ii
Luận văn thạc sĩ sinh học
1.3. TINH CHẾ PROTEIN TÁI TỔ HỢP 23
1.3.1. Tủa bằng muối .23
1.3.2. Sự thẩm tích 23
1.3.3. Sắc ký 23
1.3.3.1. Sắc ký trao đổi ion (Ion exchange chromatography – IEC) .25
1.3.3.2. Sắc ký ái lực (Affinitive chromatography, AC) .26
VẬT LIỆU-PHƯƠNG PHÁP .28
2.1. VẬT LIỆU .29
2.1.1. Thiết bị – Dụng cụ 29
2.1.2. Hóa chất và môi trường .30
2.1.2.1. Hóa chất .30
2.1.2.2. Môi trường .34
2.1.3. Vật liệu sinh học 34
2.1.3.1. Chủng vi sinh vật .34
2.1.3.2. Plasmid .34
2.1.3.3. Thang chuẩn .35
2.2. PHƯƠNG PHÁP 36
2.2.1. Cấu trúc chủng E. coli DH5α mang plasmid tái tổ hợp pET-fgf2 .37
2.2.1.1. Thu nhận gen fgf-2 bằng phản ứng PCR 37
2.2.1.2. Tách chiết, thu nhận plasmid pET-His .37
2.2.1.3. Xử lý gen fgf2 và plasmid vector pET-His bằng enzyme cắt hạn chế .39
2.2.1.4. Phản ứng nối tạo vector tái tổ hợp pET-fgf2 39
2.2.1.5. Biến nạp sản phẩm nối vào E. coli DH5α 40
2.2.1.6. Sàng lọc thể biến nạp mang plasmid tái tổ hợp pET-fgf2 41
2.2.2. Cấu trúc chủng E. Coli BL21(DE3) mang plasmid tái tổ hợp pET-fgf2 44
2.2.2.1. Thu nhận plasmid pET-fgf2 .44
2.2.2.2. Biến nạp plasmid pET-fgf2 vào E. coli BL21(DE3) 44
2.2.2.3. Sàng lọc thể biến nạp bằng phương pháp PCR khuẩn lạc .44
iii
Luận văn thạc sĩ sinh học
2.2.3. Biểu hiện protein FGF-2 tái tổ hợp dạng tan trong E. coli BL21(DE3) .44
2.2.3.1. Cảm ứng biểu hiện protein FGF-2 .44
2.2.3.2. Thu mẫu và xử lý mẫu .45
2.2.4. Bước đầu lên men bằng hệ thống lên men ở quy mô 1 lít để thu nhận protein FGF-2 tái tổ hợp ở dạng tan 45
2.2.4.1. Các bước chuẩn bị 45
2.2.4.2. Lên men cảm ứng biểu hiện FGF-2 .47
2.2.4.3. Đánh giá hiệu quả lên men .47
2.2.5. Tinh chế FGF-2 .48
2.2.5.1. Tinh chế bằng sắc ký trao đổi cation 48
2.2.5.2. Tinh chế bằng sắc ký ái lực heparin .49
2.2.6. Các phương pháp phân tích protein 50
2.2.6.1. Phương pháp điện di SDS-PAGE 50
2.2.6.2. Phương pháp nhuộm gel điện di 51
2.2.6.3. Kiểm tra bằng phương pháp lai Western Blot .51
2.2.6.4. Định lượng protein bằng phương pháp Bradford .53
2.2.6.5. Định lượng FGF-2 bằng phần mềm xác định đậm độ Quantity One 54
KẾT QUẢ-BIỆN LUẬN .56
3.1 Cấu trúc chủng E. coli DH5α mang plasmid tái tổ hợp pET-fgf2 .57
3.1.1. Thu nhận gen fgf2 bằng phản ứng PCR 57
3.1.2. Thu nhận và xử lý plasmid pET-His bằng 2 enzyme BamHI và NdeI .58
3.1.3. Biến nạp sản phẩm nối vào E. coli DH5α .59
3.1.4. Sàng lọc thể biến nạp mang plasmid tái tổ hợp pET-fgf2 .60
3.1.5. Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET-His-fgf2 bằng phương pháp PCR và enzyme
cắt giới hạn 61
3.1.6. Kiểm tra giải trình tự gen fgf2 .63
3.2. Cấu trúc chủng E. coli BL21(DE3) biểu hiện protein fgf-2 63
3.2.1. Biến nạp plasmid pET-fgf2 vào E. coli BL21(DE3) .63
iv
Luận văn thạc sĩ sinh học
3.2.2. Sàng lọc thể biến nạp bằng phương pháp PCR khuẩn lạc 64
3.3. Xác nhận sự biểu hiện của protein tái tổ hợp FGF-2 trong chủng BL21(DE3) /
pET-fgf2 65
3.4. Bước đầu lên men bằng hệ thống lên men ở quy mô 1 lít để thu nhận protein FGF
-2 tái tổ hợp dạng tan .67
3.4.1. Xây dựng đường cong tăng trưởng .67
3.4.2. Khảo sát sự biểu hiện protein FGF-2 theo thời gian cảm ứng 68
3.4.3. Khảo sát chu kì phá tế bào bằng áp suất cao .69
3.5. Tinh chế FGF-2 72
3.5.1. Tinh chế bằng sắc ký trao đổi cation .72
3.5.2. Tinh chế bằng sắc ký ái lực với heparin .73
KẾT LUẬN-ĐỀ NGHỊ .76
KẾT LUẬN .77
ĐỀ NGHỊ 77
TÀI LIỆU THAM KHẢO 78
PHỤ LỤC 82