Thạc Sĩ Tạo dòng, biểu hiện và tinh chế hFGF-2 (FIBROBLAST GROWTH FACTOR-2) tái tổ hợp từ Escherichia coli

Tạo dòng, biểu hiện và tinh chế hFGF-2 (FIBROBLAST GROWTH FACTOR-2) tái tổ hợp từ Escherichia coli
MỤC LỤC
MỤC LỤC .i
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v
DANH MỤC HÌNH vii
DANH MỤC BẢNG .ix
LỜI MỞ ĐẦU .1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3
1.1. HỌ NHÂN TỐ TĂNG TRƯỞNG NGUYÊN BÀO SỢI FGF (FIBROBLAST GROWTH FACTOR) .4
1.1.1. Giới thiệu chung 4
1.1.2. Nhân tố tăng trưởng FGF-2 .7
1.1.2.1. Cấu trúc của nhân tố tăng trưởng FGF-2 .7
1.1.2.2. Hoạt tính sinh học của FGF-2 .12
1.1.2.3. Các hướng ứng dụng của FGF-2 13
1.2. BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP Ở Escherichia coli 16
1.2.1. Giới thiệu chung 16
1.2.2. Các vị trí biểu hiện protein tái tổ hợp .18
1.2.2.1. Biểu hiện ở tế bào chất .18
1.2.2.2. Biểu hiện ở chu chất .18
1.2.2.3. Tiết ra môi trường 19
1.2.3. Một số hệ thống cảm ứng biểu hiện ở E. coli .19
1.2.3.1. Hệ thống cảm ứng bởi IPTG 19
1.2.3.2. Hệ thống cảm ứng bởi L – arabinose .22
1.2.3.3. Hệ thống cảm ứng bởi muối .22
ii
Luận văn thạc sĩ sinh học
1.3. TINH CHẾ PROTEIN TÁI TỔ HỢP 23
1.3.1. Tủa bằng muối .23
1.3.2. Sự thẩm tích 23
1.3.3. Sắc ký 23
1.3.3.1. Sắc ký trao đổi ion (Ion exchange chromatography – IEC) .25
1.3.3.2. Sắc ký ái lực (Affinitive chromatography, AC) .26
VẬT LIỆU-PHƯƠNG PHÁP .28
2.1. VẬT LIỆU .29
2.1.1. Thiết bị – Dụng cụ 29
2.1.2. Hóa chất và môi trường .30
2.1.2.1. Hóa chất .30
2.1.2.2. Môi trường .34
2.1.3. Vật liệu sinh học 34
2.1.3.1. Chủng vi sinh vật .34
2.1.3.2. Plasmid .34
2.1.3.3. Thang chuẩn .35
2.2. PHƯƠNG PHÁP 36
2.2.1. Cấu trúc chủng E. coli DH5α mang plasmid tái tổ hợp pET-fgf2 .37
2.2.1.1. Thu nhận gen fgf-2 bằng phản ứng PCR 37
2.2.1.2. Tách chiết, thu nhận plasmid pET-His .37
2.2.1.3. Xử lý gen fgf2 và plasmid vector pET-His bằng enzyme cắt hạn chế .39
2.2.1.4. Phản ứng nối tạo vector tái tổ hợp pET-fgf2 39
2.2.1.5. Biến nạp sản phẩm nối vào E. coli DH5α 40
2.2.1.6. Sàng lọc thể biến nạp mang plasmid tái tổ hợp pET-fgf2 41
2.2.2. Cấu trúc chủng E. Coli BL21(DE3) mang plasmid tái tổ hợp pET-fgf2 44
2.2.2.1. Thu nhận plasmid pET-fgf2 .44
2.2.2.2. Biến nạp plasmid pET-fgf2 vào E. coli BL21(DE3) 44
2.2.2.3. Sàng lọc thể biến nạp bằng phương pháp PCR khuẩn lạc .44
iii
Luận văn thạc sĩ sinh học
2.2.3. Biểu hiện protein FGF-2 tái tổ hợp dạng tan trong E. coli BL21(DE3) .44
2.2.3.1. Cảm ứng biểu hiện protein FGF-2 .44
2.2.3.2. Thu mẫu và xử lý mẫu .45
2.2.4. Bước đầu lên men bằng hệ thống lên men ở quy mô 1 lít để thu nhận protein FGF-2 tái tổ hợp ở dạng tan 45
2.2.4.1. Các bước chuẩn bị 45
2.2.4.2. Lên men cảm ứng biểu hiện FGF-2 .47
2.2.4.3. Đánh giá hiệu quả lên men .47
2.2.5. Tinh chế FGF-2 .48
2.2.5.1. Tinh chế bằng sắc ký trao đổi cation 48
2.2.5.2. Tinh chế bằng sắc ký ái lực heparin .49
2.2.6. Các phương pháp phân tích protein 50
2.2.6.1. Phương pháp điện di SDS-PAGE 50
2.2.6.2. Phương pháp nhuộm gel điện di 51
2.2.6.3. Kiểm tra bằng phương pháp lai Western Blot .51
2.2.6.4. Định lượng protein bằng phương pháp Bradford .53
2.2.6.5. Định lượng FGF-2 bằng phần mềm xác định đậm độ Quantity One 54
KẾT QUẢ-BIỆN LUẬN .56
3.1 Cấu trúc chủng E. coli DH5α mang plasmid tái tổ hợp pET-fgf2 .57
3.1.1. Thu nhận gen fgf2 bằng phản ứng PCR 57
3.1.2. Thu nhận và xử lý plasmid pET-His bằng 2 enzyme BamHI và NdeI .58
3.1.3. Biến nạp sản phẩm nối vào E. coli DH5α .59
3.1.4. Sàng lọc thể biến nạp mang plasmid tái tổ hợp pET-fgf2 .60
3.1.5. Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET-His-fgf2 bằng phương pháp PCR và enzyme
cắt giới hạn 61
3.1.6. Kiểm tra giải trình tự gen fgf2 .63
3.2. Cấu trúc chủng E. coli BL21(DE3) biểu hiện protein fgf-2 63
3.2.1. Biến nạp plasmid pET-fgf2 vào E. coli BL21(DE3) .63
iv
Luận văn thạc sĩ sinh học
3.2.2. Sàng lọc thể biến nạp bằng phương pháp PCR khuẩn lạc 64
3.3. Xác nhận sự biểu hiện của protein tái tổ hợp FGF-2 trong chủng BL21(DE3) /
pET-fgf2 65
3.4. Bước đầu lên men bằng hệ thống lên men ở quy mô 1 lít để thu nhận protein FGF
-2 tái tổ hợp dạng tan .67
3.4.1. Xây dựng đường cong tăng trưởng .67
3.4.2. Khảo sát sự biểu hiện protein FGF-2 theo thời gian cảm ứng 68
3.4.3. Khảo sát chu kì phá tế bào bằng áp suất cao .69
3.5. Tinh chế FGF-2 72
3.5.1. Tinh chế bằng sắc ký trao đổi cation .72
3.5.2. Tinh chế bằng sắc ký ái lực với heparin .73
KẾT LUẬN-ĐỀ NGHỊ .76
KẾT LUẬN .77
ĐỀ NGHỊ 77
TÀI LIỆU THAM KHẢO 78
PHỤ LỤC 82