Luận Văn Tạo chủng và xác định đặc tính sinh hóa của Salmonella choleraesuisSmith đột biến gen asd

Đồ án tốt nghiệp năm 2012
Đề tài: Tạo chủng và xác định đặc tính sinh hóa của Salmonella choleraesuisSmith đột biến gen asd


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN i
MỤC LỤC ii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮVIẾT TẮT v
DANH MỤCCÁC BẢNG vii
DANH MỤC CÁC HÌNH ix
MỞĐẦU 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 4
1.1. Đại cương vềvi khuẩn S. choleraesuis Smith . 4
1.1.1. Phân loại khoa học của S. choleraesuis 4
1.1.2. Đặc điểm hình thái . 4
1.1.3. Đặc tính nuôi cấy và sinh hóa . 5
1.1.4. Sức đềkháng 7
1.1.5. Cấu trúc kháng nguyên . 7
1.1.6. Tính gây bệnh . 10
1.2. Bệnh Phó thương hàn . 10
1.2.1. Đặc điểm và nguyên nhân gây bệnh 10
1.2.2. Cơ chếsinh bệnh 11
1.2.3. Triệu chứng 11
1.2.4. Bệnh tích 11
1.2.5. Phòng bệnh 12
1.2.6. Điều trị . 13
1.3. Tình hình nghiên cứu vềtạo chủng S. choleraesuisđột biến gen 13
iii
1.4. Gen asd 17
1.5. Vector 18
1.5.1. Khái niệm . 18
1.5.2. Các đặc điểm chính của vector . 19
1.5.3. Các bước trong tạo DNA tái tổhợp 20
1.6. Plasmid dùng trong kỹthuật tạo dòng . 20
1.6.1. Plasmid pBluescript II SK(+) (pBSIIK+) . 21
1.6.2. Plasmid pRE112 23
1.7. Tếbào chủđểkhuếch đại gen . 24
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 25
2.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu . 25
2.2. Vật liệu dùng cho nghiên cứu . 25
2.2.1. Các chủng vi sinh vật 25
2.2.2. Hóa chất và môi trường 25
2.2.3. Thiết bịchuyên dụng . 28
2.3. Phương pháp nghiên cứu, kỹthuật sửdụng 28
2.3.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số . 28
2.3.2. Phương pháp tách chiết DNA plasmid 29
2.3.3. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR sau điện di . 30
2.3.4. Phương pháp PCR 31
2.3.5. Phương pháp biến nạp của Kang và cs . 36
2.3.6. Phương pháp tạo tếbào E. coli χ7213 khảbiến . 37
2.3.7. Phương pháp tiếp hợp của Kang và cs 38
2.3.8. Phương pháp lên men các loại đường . 39
2.3.9. Phương pháp kiểm tra tính ổn định của gen asd đột biến 39
2.3.10. Bốtrí thí nghiệm . 39
iv
Chương 3. KẾT QUẢVÀ THẢO LUẬN . 41
3.1. Khuếch đại đoạn gen Pa12, Pa34 . 41
3.2. Tạo dòng plasmid tái tổhợp pBSIIK(+)/Δasd 42
3.3. Tạo dòng plasmid tái tổhợp pRE112/Δasd 44
3.4. Tạo chủngS. choleraesuis mang gen asdđột biến . 46
3.5. Sàng lọc dòng tếbào S. choleraesuis mang genasd đột biến . 48
3.6. Kiểm tra các đặc tính của chủngS. choleraesuis/Δasd 49
3.6.1. Tốc độsinh trưởng của S. choleraesuis/Δasd 49
3.6.2. Khảnăng lên men đường của S. choleraesuis /Δasd . 50
3.6.3. Kết quảkiểm tra tính ổn định của chủng đột biến . 51
3.6.4.Giải trình tựgen asd của S. choleraesuis/Δasd . 52
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ . 56
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 59
v
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮVIẾT TẮT
STT Kí hiệu Tên đầy đủ
1
asd
Aspartate β-semialdehyde dehydrogenase
2
bp
Base pair
3
CIP
Calf alkaline phosphatase
4
Cm
Chloramphenicol
5
Cm
r
Gen kháng kháng sinh Chloramphenicol
6
CIRAD
Centre de coopération Iternationale en Recherche
agronomique pour le Dévelopment (French Agricultural
Research Centre for International Development)
7
DAP
DL-α, ε-Diaminopimelic acid
8 DNA Deoxyribonucleic acid
9 E. coli Escherichia coli
10 F Forward
11 Kb Trạng Quỳnhbase
12 Km Kanamycin
vi
13
LB
Luria Bertani
14
NA
Nutrient agar
15
NB
Nutrient broth
16
PBS
Phosphate buffer saline
17
PCR
Polymeration ChainReaction
18
R
Reverse
19
S. choleraesuis
Salmonella choleraesuis
20
TBE
Tris-Borate-EDTA
21
Δasd
Gen asdbịđột biến
vii
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng thống kê tình hình nhiễm bệnh do Salmonellagây ra 2
Bảng 1.1. Các loại môi trường nuôi cấy vi khuẩn S. choleraesuis 5
Bảng 1.2. Tính trạng chủyếu của các loài, loài phụvà đa dạng sinh học của
Salmonella . 6
Bảng 1.3. Sức đềkháng của S. choleraesuis 7
Bảng 1.4. Các dạng huyết thanh chủyếu và tính gâybệnh của Salmonella . 9
Bảng 1.5. Các nhóm plasmid chính và đặc điểm 21
Bảng 2.6. Các plasmid dùng trong nghiên cứu . 25
Bảng 2.7. Các bộkit được dùng trong nghiên cứu . 26
Bảng 2.8. Các cặp mồi dùng cho phản ứng PCR 26
Bảng 2.9. Các enzyme cắt giới hạn 27
Bảng 2.10. Thành phần các môi trường nuôi cấy . 27
Bảng 2.11. Thành phần cho một mẫu phản ứng PCR (nhân gen asd) . 31
Bảng 2.12. Bảng chu trình nhiệt (nhân gen asd) 31
Bảng 2.13. Thành phần cho một mẫu phản ứng PCR (kiểm tratạo dòng plasmid) . 32
Bảng 2.14. Bảng chu trình nhiệt (kiểm tra tạo dòng plasmid) . 32
Bảng 2.15. Thành phần cho một mẫu phản ứng PCR (kiểm tra gây đột biến) 33
Bảng 2.16. Bảng chu trình nhiệt (kiểm tra gây đột biến) 33
Bảng 2.17. Thành phần cho một mẫu phản ứng colony PCR . 34
Bảng 2.18. Bảng chu trình nhiệt cho phản ứng Colony 34
viii
Bảng 2.19. Thành phần phản ứng cắt DNA bằng enzyme cắt giới hạn . 35
Bảng 2.20. Thành phần phản ứng cắt plasmid bằng enzyme giới hạn . 35
Bảng 2.21. Thành phần phản ứng lai 36
Bảng 2.22. Nguyên vật liệu dùng trong phương pháp biến nạp của Kang và cs 36
Bảng 2.23. Nguyên vật liệu trong phương pháp tạo tếbào E. coli χ7213 khảbiến . 37
Bảng 2.24. Nguyên vật liệu của phương pháp tiếp hợp . 38
Bảng 3.25. Tốc độsinh trưởng của 2 chủng S. choleraesuisvà 49
S. choleraesuis/Δasd 49
Bảng 3.26. Khảnăng lên men đường của S. choleraesuis  S. cholersesuis/Δasd 51
ix
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Đặc điểm hình thái vi khuẩn S. choleraesuischủng Smith 4
Hình 1.2. Hình ảnh khuẩn lạc vi khuẩn S. choleraesuischủng Smith . 57
Hình 1.3. Các kháng nguyên bềmặt của Salmonella. . 8
Hình 1.4. Sơ đồcon đường xâm nhập gây bệnh của S. choleraesuis . 11
Hình 1.5. Vector nhân lên trong tếbào nhận 18
Hình 1.6. Cấu trúc của vector 19
Hình 1.7. Các bước tạo DNA tái tổhợp .20
Hình 1.8. Plasmid pBluescrip II SK (+) . 22
Hình 1.9. Plasmid pRE112 23
Hình 2.10. Sơ đồbốtrí thí nghiệm .40
Hình 3.11. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen Pa12, Pa34 . 42
Hình 3.12. Kết quảđiện di kiểm tra sản phẩm cắt 2 dòng chọn lọc vector tái tổhợp
pBSIIK(+)/Pa12 43
Hình 3.13. Kết quảđiện di kiểm tra sản phẩm cắt 6 dòng chọn lọc vector tái tổhợp
pBSIIK(+)/Δasd 44
Hình 3.14. Kết quảđiện di kiểm tra sản phẩm cắt pBSIIK(+)/Δasd . 45
Hình 3.15. Kết quảđiện di kiểm tra sản phẩm cắt của 3 dòng chọn lọc vector tái tổ
hợp pRE112/Δasd . 46
Hình 3.16. Khuẩn lạc S. choleraesuissau khi tiếp hợp với E. coli
χ7213/pRE112/Δasd 47
Hình 3.17. Kết quảđiện di kiểm tra sản phẩm PCR từhệgen của chủng .
x
S. choleraesuisvới cặp mồi Pa5F-Pa6R (A) và Pa6R-Pa7F (B) . 48
Hình 3.18. Khuẩn lạc vi khuuẩnS. choleraesuisSmith và S. choleraesuis/Δasd 57
Hình 3.19. Đường cong sinh trưởng của S. choleraesuisSmith và .
S. choleraesuis/Δasd 50
Hình 3.20. Khảnăng lên men đường của S. choleraesuis /Δasd . 58
Hình 3.21. Khảnăng lên men đường của S. choleraesuisSmith 59
Hình 3.22. Sản phẩm PCR từhệgen của S. choleraesuisSmith và
S.cholereasuis/Δasdcác đời 1, 5, 10, 15, 20 với cặp mồi Pa5F -Pa6R (trắng) .
và Pa7F -Pa6R (đỏ) . 52
Hình 3.23. So sánh trình tựgen Δasdcủa S. choleraesuisvới asdcủa .
S. choleraesuisSmith 55
1
MỞĐẦU
Trong thời gian gần đây ngành chăn nuôi ởnước ta được khởi sắc và có sự
tăng trưởng khá cao, đạt 24% giá trịtổng sản lượng ngành nông nghiệp. Theo kết
quảđiều tra tại thời điểm 01/4/2010, cảnước có 6 triệu con bò, 2,9 triệu con trâu,
27,3 triệu con lợn, 4 triệu con gia cầm [1].Chiếm tỉlệlớn trong ngành chăn nuôi là
ngành chăn nuôi lợn. Mục tiêu của kếhoạch phát triển chăn nuôi lợn ởViệt Nam
theo chiến lược phát tiển chăn nuôi đến năm 2020: đàn lợn từ27,3 triệu con năm
2010, lên 32,9 triệu con năm 2015 và lên 34,7 triệu con năm 2020. Sản lượng thịt
hơi từ3,1 triệu tấn năm 2010 lên 3,9triệu tấn năm 2015 và 4,8 triệu tấn năm 2020.
Sản lượng thịt xẻtừ2191,3 ngàn tấn năm 2010 lên 2794,4 ngàn tấn năm 2015 và
3493,1 ngàn tấn năm 2020. Trong đó đàn lợn nuôi công nghiệp 5,8 triệu con (chiếm
19,3%) năm 2010 lên 8,9 triệu con (chiếm 27,0%) năm 2015 lên 12,9 triệu con (
chiếm 37,0%) năm 2020. Sản lượng thịt hơi nuôi công nghiệp từ1135,2 ngàn tấn
(chiếm 36,5%) năm 2010 lên 1851,5 ngàn tấn (chiếm 47,2%) năm 2015 và 2866
ngàn tấn (chiếm 59%) năm 2020 [1].
Đểđạt được những mục tiêu có tính chiến lược đó, việc đầu tư cho công tác
giống, quan tâm đến vấn đềthức ăn, các chương trình quản lý, đặc biệt nhiệm vụ
của ngành chăn nuôi -thúy càng nặng nềhơn, tăng cường áp dụng các biện pháp
khoa học, kỹthuật cho công tác phòng, chống dịch bệnh ởvậtnuôi có hiệu quảlà
điều hết sức quan trọng.
Tuy nhiêm vấn đềđặt ra cho ngành chăn nuôi nói chung, và ngành nuôi lợn
nói riêng là tình hìnhdịch bệnh liên tục xảy ra và gây thiệt hại rất lớn. Một trong
những bệnh thường gặp phải kểđến là bệnh tiêu chảydo vi khuẩn Salmonellagây
ra ởlợn sau cai sữa, còn gọi là bệnh Phó thương hàn, tuy không nổra thành dịch lớn
nhưng với đặc điểm dịch tễhết sức phức tạp, đã và đang gây nên những thiệt hại
đáng kểcho người chăn nuôi.
Bệnh do Salmonellaxảy ra trên toàn cầu trong đó tập trung chủyếu ởcác
nước châu Âu, châu Mỹđiển hìnhlà Anh, Pháp, Mỹ, Hà Lan, v.v
2
Bảng thốngkê tình hìnhnhiễm bệnh do Salmonellagây ra
Năm Quốc gia Tình hìnhnhiễm bệnh
Pháp
Trong số7449 bệnh nhân bịnhiễm độc thức ăn đã
có tới 3131 bệnh nhân do Salmonellagây ra.
1995
Đan Mạch
Có 2.911 trường hợp nhiễm Salmonella, trong đó
có 19 gây bệnh thương hàn do ăn thức ăn là trứng
và các sản phẩm của trứng bịnhiễm vi khuẩn này.
Hàn Quốc
Có 25,9% mẫu thịt gà tươi sống bịnhiễm
Salmonella.
1999
Hà Lan Có 23% thịt lợn nhiễm Salmonella spp.
Hàng
năm
Mỹ
Có khoảng 4000 trường hợp mắc bệnh do thực
phẩm bịnhiễm Salmonella spp.
Có thểnói rằng ởbất kỳmột cơ sởchăn nuôi nào dù quy mô lớn hay nhỏđều
có thểxuất hiện bệnh này. Khi đời sống của nhân dân ngày càng được nâng cao,
vấn đềan toàn thực phẩm trong đó có lợn và thịt lợn sạch bệnh, không bịnhiễm
Salmonellalà một yêu cầu cấp thiết.
Các đàn lợn bịnhiễm Salmonellakhông những gây thiệt hại kinh tếcho
người chăn nuôi mà còn là nguồn tàng trữmầm bệnh gây hại đối với con người. Bởi
vậy mà mỗi biện pháp ngăn chặn có hiệu quả ởgia súc đều cần thiết và là điều kiện
tiên quyết góp phần giảm thiểu dịch bệnh, tăng thu nhập cho người chăn nuôi,
chống ô nhiễm môi trường và bảo vệsức khoẻ cộng đồng.
Do đó, việc giảm tỷlệcác trại bịnhiễm mầm bệnh Salmonellasẽlàm cho sự
an toàn thịt lợn tăng lên, và mục tiêu của các nhà khoa học, nhà sản xuất là xây
dựng các đàn gia súc sạch Salmonella. Chính vì thếmàviệc nghiên cứu tạo ra các
chủng Salmonellanhược độc ứng dụng trong sản xuất vacxinphòng bệnh ởlợn,
phát hiện sớm và tìm ra hướng phòng, trịbệnh có hiệu quảluôn là những việc làm
cấp thiết.
3
Xuất phát từthực tiễn nghiên cứu và yêu cầu của sản xuất, chúng tôi tiến
hành nghiên cứu "Tạo chủng và xác định đặc tính sinh hóa của Salmonella
choleraesuisSmith đột biến gen asd” đây là một nhánh nhỏtrong đềtài cấp nhà
nước.
Mục tiêu nghiên cứu
 Tạo chủng S. choleraesuisđột biến gen asdbằng cách gây đột biến mất
đoạn sửdụng công nghệDNA tái tổhợp.
 Kiểm tra các đặc tính sinh hóa của S. choleraesuismang gen asd bị đột
biến.
 Mởrộng ứng dụng chủng vi khuẩn này làm chủng vacxintái tổhợp mang
plasmid đã được dòng hóa các kháng nguyên ngoại lai. (ví dụkháng nguyên F18ab,
Stx2e của vi khuẩn E. coli).
Nội dung nghiên cứu
1. Tạo dòng plasmid pRE112/Δasd.
2. Kiểm tra kết quảtạo dòng plasmid pRE112/Δasd.
3. Chuyển nạp plasmid pRE112/Δasdvào chủng S. choleraesuis nhược độc gây
đột biến gen asd.
4. Kiểm tra kết quảgây đột biến gen asdbằng phản ứng PCR, giải trình tự.
5. Kiểm tra đặc tính sinh hóa của chủng S. choleraesuisnhược độc mang gen asd
bịđột biến.
4
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đại cương vềvi khuẩn S. choleraesuis Smith
Salmonella do Daniel E. Salmon (1850 - 1914) phát hiện ra vào năm
1885. Năm 1880, Grafhy mô tả hình ảnh vi khuẩn quan sát được trên tiêu bản và
là người đầu tiên phân lập được S. typhi vào năm 1884 [4].
S. choleraesuislà mộttrong những vi khuẩn gây bệnh Phó thương hàn lợn.
Lợn bịnhiễm S. choleraesuiscó cácbiểu hiện bao gồm viêm dạdày, ruột, viêm
phổi, viêm gan, viêm màng não [17].
1.1.1. Phân loại khoa học của S. choleraesuis
Giới (regnum): Bacteria
Ngành (phynum) : Proteobacteria
Lớp (class) : Gamaproteobacteria
Bộ(ordo) : Enterobacteriales
Họ(familia) : Enterobacteriaceae
Chi (genus) : Salmonella
Loài (species) : S. choleraesuis
1.1.2.Đặc điểm hìnhthái
S. choleraesuislà loại
trực khuẩn gram âm, hình gậy
ngắn, hai đầu tròn, kích thước
0,4 -0,6 × 1 -3 µm, không hình
thành giáp mô và nha bào. S.
choleraesuis có khảnăng di
động mạnh do có từ7 -12 lông
quanh thân [3].
Hình 1.1. Đặc điểm hình thái vi
khuẩn S. choleraesuischủng Smith.
5
1.1.3.Đặc tính nuôi cấy và sinh hóa
S. choleraesuislà vi khuẩn yếm khí tùy tiện, có khảnăng chuyển hóa
đường, khửnitrat thành nitrit [4].
Bảng1.1. Các loại môi trường nuôi cấy vi khuẩn S. choleraesuis
Môi trường Đặc điểm
Nước thịt
Nuôi cấy 24h sau môi trường đục đều, đểlâu thì
dưới đáy có cặn, trên mặt môi trường có màng mỏng.
Thạch thường
Khuẩn lạc có dạng S tròn, gọn, trong sáng, ẩm ướt
nhẵn bóng, xung quanh khuẩn lạc có một bờchất dính
lầy nhầy (Hình 1.2).
Thạch Istrati Khuẩn lạc có màu xanh
Thạch máu Không dung huyết
Lên men và sinh hơi các loại đường chính:
glucoza, galactoza, mantoza, levuloza, mannit, v.v
Môi trường đường
Không lên men và không sinh hơi: lactoza,
saccaroza, arabinoza.
H2S : +
Indol : -MR(methyl rouge) : -Các phản ứng khác
VP(voges prosskauer) : -
6
Bảng1.2. Tính trạng chủyếu của các loài, loài phụvà đa dạng sinh học của
Salmonella [3]


TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu trong nước
1. Quyết định của Thủtướng chính phủsố10/2008/QĐ-TTg, (2008), Chiến lược
phát triển chăn nuôi đến năm 2020.
2. Nguyễn Hoàng Lộc, Lê Việt Dũng, Trần Quốc Dung, 2007, Công nghệDNA tái
tổhợp, Đại Học quốc gia TPHCM.
3.Phạm Hồng Sơn, 2002, Giáo trình vi sinh vật học thú y, Đại Học Nông Lâm Huế.
4. Nguyễn Như Thanh, Phùng Quốc Chướng, Phương Pháp ThựcHành Vi Sinh Vật
Thú Y, Đại Học Tây Nguyên.
5. Nguyễn ThịThanh, Giáo trình Bệnh Truyền Nhiễm, Đại Học Nông Lâm Huế.
Tài liệu nước ngoài
6. Burns-Keliher LL, Portteus A, Curtiss R., (1997), Specific detection of
Salmonella typhimuriumproteins synthesizedintracellularly, J Bacteriol, (179),
3604-3612.
7. Cersini A, Salvia AM, Bernardini ML, (1998), Intracellular multiplication and
virulence of Shigella flexneriauxotrophic mutants, Infect Immun, (66), 549-557.
8. Cardineau GA, Curtiss R., (1987), Nucleotide sequence of the asd genof
Streptococcus mutans, Identification of the promoter region and evidence for
60
attenuator-like sequences preceding the structural gen, J Biol Chem, (262), 3344-3353.
9. Galan JE, Nakayama K, Curtiss R, (1990), Cloning and characterization of the
asd genof Salmonella typhimurium: use in stable matainance of recombinant
plasmid in Salmonellavaccine strain, Gen, (94), 29-35.
10. Harb OS, Abu Kwaik Y, (1998), Identification of the aspartate-beta-semialdehyde dehydrogenase genof Legionella pneumophilaand characterization
of a null mutant, Infect Immun, (66), 1898-1903.
11. Hudson AO, Bless C, Macedo P, Chatterjee SP, Singh BK, et al, (2005),
Biosynthesis of lysine in plants: evidence for a variant of the known bacterial
pathways, Biochim Biophys Acta, (1721), 27-36.
12. Kang HY, Dozois CM, Tinge SA, Lee TH, Curtiss R, (2002), Trasduction -mediated transfer of unmarked delection and point mutations through use of
counterselectable suicidee plasmid, Joural of Bacterioly, (184), 307 -312.
13. Li MH, Robinson EH, (1998), Effects of supplemental lysine and methionine in
low protein diets on weight gain and body composition of young channel catfish
Ictalurus punctatus, Aquaculture, (163), 297-307.
14. Paidhungat M, Setlow B, Driks A, Setlow P, (2000), Characterization of spores
of Bacillus subtilis which lack dipicolinic acid, J Bacteriol, (82), 5505-5512.
15. Philippe N et, (2004), Improvement of pCVD442, a suicide plasmid plasmid for
genallele exchange in bacteria, Plasmid, ( 51), 246-255.
16. Schleifer KH, Kandler O., (1972), Peptidoglycan types of bacterial cell walls
and their taxonomic implications, Bacteriol Rev, (36), 407-477.
17. Schwartz KJ, Straw BE, D’Allaire S, Mengeling W, Taylor DJ (Eds), (1999),
Disease of swine, Iowa State University Press, Ames, 535 -551.
61
18. Shi-Zhong Geng et, 2009, Report : An Improved Method to knock out the asd
Gen of Salnonella entericasenovae Pullorum, in Journal of Biotechnology
Volume, Article ID 646380.
19. Viola RE, (2001), The central enzymes of the aspartate family of amino acid
biosynthesis, Acc Chem Res,(34), 339-349.
20. Vu KH, Miller KW, (2009), Regulation of mannose phosphotransferase system
permease and virulence gen exxpression in Listeria monocytogens by the EII(t)
Man transporter, Applied and environmental microbiology, 75 (21), 6671 -6678.
21. Xu Yin-Di et al, 2006, Construction and Characterization of ΔcrpΔasdMutant
Host-Vector Balanced Lethal System of S. choleraesuisC500 Strain, Chinese
Journal of Biotechnology.