Luận Văn Tạo chủng và kiểm tra đặc tính sinh hóa chủng Salmonella choleraesuisSmith mang gen crp đột biến

Đồ án tốt nghiệp năm 2012
Đề tài: Tạo chủng và kiểm tra đặc tính sinh hóa chủng Salmonella choleraesuisSmith mang gen crp đột biến


MỤC LỤC
MỤC LỤC . i
DANH MỤC BẢNG iv
DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ, HÌNH VẼ v
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii
MỞ ĐẦU . viii
Chương 1. Tổng quan 1
1.1 Bệnh phó thương hàn lợn . 1
1.1.1 Cơ chế sinh bệnh . 3
1.1.2 Phương thức lây truyền 3
1.1.3 Triệu chứng . 4
1.1.4 Bệnh tích . 4
1.1.5 Chẩn đoán bệnh . 4
1.1.6Phòng và trị bệnh . 6
1.2 Đặc tính của vi khuẩn Salmonella choleraesuisSmith 7
1.2.1 Đặc điểm hình thái . 8
1.2.2 Đặc điểm nuôi cấy . 8
1.2.3 Đặc điểm sinh hóa . 9
1.2.4 Cấu trúc kháng nguyên 10
1.2.5 Sức đề kháng . 13
1.2.6 Tính gây bệnh 14
1.3 Gen CRP 15
1.4 Phương pháp tạo DNA tái tổ hợp . 19
1.4.1 Nguyên tắc chung 19
1.4.2 Quy trình tạo DNA tái tổ hợp 20
1.5 Tình hình nghiên cứu gây đột biến trên một số gen gây bệnh của Salmonella
21
Chương 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu . 24
2.1 Đối tượng nghiên cứu . 24
ii
2.2 Vật liệu nghiên cứu 24
2.2.1 Vật liệu và môi trường . 24
2.2.2 Dụng cụ và thiết bị 27
2.3 Phương pháp nghiên cứu 27
2.3.1 Tách chiết plasmid . 27
2.3.2 Tách chiết genome . 28
2.3.3 Chiết tách, tinhsạch DNA . 27
2.3.4 Phản ứng PCR nhân đoạn gencrp 30
2.3.5 Phản ứng cắt với enzyme giới hạn . 31
2.3.6 Phản ứng lai ghép 32
2.3.7 Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E.coliJM109 và E.coliχ7213 32
2.3.8 Tạo chủng E.coli χ7213 khả biến . 33
2.3.9 Tiếp hợp E.coli χ7213 và Salmonella choleraesuis 34
2.3.10 Kiểm tra các đặc tínhsinh hóa . 35
Chương 3. Kết quả và thảo luận . 37
3.1. Tạo chủng vector tái tổ hợp pBSIIK+/Δcrp . 38
3.1.1. Khuếch đại đoạn gen Pr12, Pr34 với enzyme Pwo -polymerase . 38
3.1.2. Tạo dòng vectortái tổ hợp pBSIIK+/Δcrp 39
3.2. Tạo dòng plasmid tái tổ hợpẠO pRE112/Δcrp 40
3.3. Tạo chủng S. choleraesuisSmith mang gen crpđột biến . 41
3.3.1. Tiếp hợp E.coliχ7213/pRE112/Δcrp với S. choleraesuis 41
3.3.2. Sàng lọc dòng tế bào S. choleraesuismang gen crp đột biến . 42
3.4. Kết quả giám định đặc tính sinh hóa của chủng S. choleraesuisnhược độc
mang gencrpđã bị đột biến . 44
3.4.1. Tốc độ sinh trưởng 44
3.4.2. Đặc tính sinh hóa 45
3.4.3. Tính ổn định của chủng đột biến . 47
3.4.4. Giám định kháng nguyên H, O . 48
3.4.5. So sánh trình tự gen của S. choleraesuisSmith và S. choleraesuis/Δcrp 48
iii
Kết luận và kiến nghị . 50
TÀI LIỆU THAM KHẢO . 51
iv
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1 Đặc tính sinh hóa của một số loài Salmonella . 9
Bảng 1.2 Định type huyết thanh học (serotyp) của vi khuẩn Salmonella(Theo
Kauffman (1972) ). 12
Bảng 1.3 Các gen bị mất và chức năng của chúng trong phát triển các chủng
Salmonella spp. đã giảm độc lực 22
Bảng 2.1 Các cặp mồi dùng cho phản ứng PCR . 26
Bảng 2.2 Thành phần của bộ kit QIApre spin Miniprep Kit của QIAgen . 28
Bảng 2.3 Thànhphần của bộ kit Blood&Tissue Extraction của QIAgen 27
Bảng 2.4 Thành phần của bộ kit QIA Quick Gel Extraction của hãng QIAgen 30
Bảng 2.5 Thành phần cho một mẫu phản ứng PCR 30
Bảng 2.6 Thành phần của phản ứng cắt DNA bằng enzyme cắt giới hạn (RE) . 31
Bảng 2.7 Thành phần của phản ứng cắt plasmid bằng enzyme RE . 32
Bảng 2.8 Thành phần phản ứng lai ghép sử dụng T4 ligase 32
Bảng 3.1: Các đặc tính sinh hóa của chủng S. choleraesuisSmith và
S.choleraesuis/Δcrp . 47
v
DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ,HÌNH VẼ
Hình 1.1 Lợn con 3 tháng tuổi chết do bị nhiễm S.choleraesuis. 2
Hình 1.2: Hình thái vi khuẩn S. choleraesuis[31]. . 8
Hình 1.3 Khuẩn lạc S. choleraesuis trên thạch máu 24 giờ 9
Hình 1.4 Cấu trúc cAMP . 15
Hình 1.5 Class I CAP-dependent promoter activation 16
Hình 1.6 Class II CAP-dependent promoter activation . 16
Hình 1.7 Class III CAP-dependent promoter activation . 16
Hình 1.8 Mối liên hệ giữa lượng đường và nồng độ cAMP.(Nguồn Scitable by
nature education) . 18
Hình 1.9 Quy trình biến nạp DNA tái tổ hợp với vector là plasmid, tế bào nhận là
E.coli . 20
Hình 1.10 Sàng lọc dòng vi khuẩn mang gen tái tổ hợp thành công dựa vào gen
kháng Ampicilin 21
Hình 3.1: Điện di kiểm tra sản phẩm PCR chạy từ khuôn là DNA tổng số của vi
khuẩn S. choleraesuisvới cặp mồi Pr1F-Pr2R, và Pr3F-Pr4R trên gel agarose 1,2%.
38
Hình 3.2: Điện di kiểm tra tách chiết vector pBSIIK+ (A), sản phẩm cắt ADN
plasmid của 4 dòng vector tái tổ hợp pBSIIK+/Pr12 với BamHI/XbaI (B) và 3 dòng
pBSIIK(+)/Δcrp (C) với XhoI/KpnI. 40
Hình 3.3: Điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân lên từ khuôn là plasmid tái tổ hợp
pBSIISK+/Pr12-1/Pr34-1 bằng cặp mồi Pr1F-Pr4R trên gel agarose 1,2%. . 40
Hình 3.4: Điện di kiểm tra sản phẩm cắt của 5 dòng chọn lọc vector tái tổ hợp
pRE112/Δcrp bằng cặp enzyme XbaI và KpnI trên gel agarose 1,2%. . 41
Hình 3.5 Các khuẩn lạc S. choleraesuissau khi tiếp hợp với E.coli
χ7213/pRE112/Δcrp-4 mọc trên môi trường chọn lọc LB + Cm. . 42
vi
Hình 3.6 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR từ genome của S. choleraesuis 539/Δcrp
(1), S. choleraesuisSmith (2), plasmid của χ7213/pRE112/Δcrp (3) với cặp mồi
Pr5F-Pr6R (ảnh trái), và Pr6R-Pr7F (ảnh phải) trên gel agarose 1,2%. 43
Hình 3.7 Hình ảnh khuẩn lạc của S.chorelasuis Smith và S. chorelasuis539/Δcrp
sau 24h nuôi cấy. . 44
Hình 3.8 Biểu đồ tốc độ sinh trưởng của các chủng S. choleraesuisΔcrpvà S.
choleraesuisSmith trong 10 giờ nuôi cấy 45
Hình 3.9 Kết quả kiểm tra đặc tính sinh hóa của chủng S. choleraesuisSmith và
S.choleraesuis/Δcrp . 46
Hình 3.10 Sản phẩm PCR từ genome của S. cholerasuis539/Δcrp với cặp mồi
Pr5F-Pr6R, Pr6R-Pr7F ở các đời 1, 5, 10, 15, 20 . 47
Hình3.11 Trình tự đoạn gen khuếch đại từ cặp mồi Pr5F-Pr6R của gen Δcrpvới
đoạn 322 bp (545-867) (bôi đen) bị mất so với gen crpcủa Salmonella choleraesuis
nhược độc 49
vii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
STT Kí hiệu Chữ viết tắt
1 CIP Calf alkaline phosphatase
2 Cm Chloramphenicol
3 Cm
r
Gen kháng kháng sinh Chloramphenicol
4 Crp cAMP receptor protein
5 Δcrp gen crp bị đột biến
6 CAP catabolite activator protein -Protein hoạt hóa dị hóa
7 Asd aspartate β–semialdehyde dehydrogenase
8 LB Luria –Bertani
9 ST Stable toxin –Độc tố chịu nhiệt
10 PBS Phosphate buffer saline –Đệm Phosphate.
11 LPS Lypopolysaccharide
12 Km Kanamycin
13 LT Labile toxin –Độc tố không bền nhiệt
14 RE Enzyme cắt giới hạn
15 KDO 2-keto-3 dexyoctonate
viii
MỞ ĐẦU
Salmonella choleraesuislà nguyên nhân gây ra hàng loạt dịch bệnh gây chết ở
lợn, đồng thời cũng là nguyên nhân dẫn đến nhiễm trùng máuvà tử vong ở người
(Jean và cộng sự, 2006). Phòng bệnh do S. choleraesuis gây ra là ưu tiên hàng đầu
của nhà chăn nuôi. Việc sử dụng chủng Salmonella nhược độc làm vắc-xin đang
được quan tâm, chú ý trong những năm gần đây vì vắc-xin nhược độchiệu quả hơn
nhiều so với vắc-xin chết hay vắc-xin tiểu phần trong việc kích thích hệ thống miễn
dịch ở lợn.
Hiện nay,trên thị trường có rất nhiều loại vắc-xin, trong đó hai loại vắc-xin vô
hoạt và vắc-xin nhược độc được sử dụng nhiều nhất. Vắc-xin vô hoạt ít hiệu quả
hơn so với các loại vắc-xin sống nhược độc [15].Những năm gần đây có rất nhiều
nghiên cứu và số liệu liên quan đến quy trình sản xuất các loại vắc-xin sống nhược
độc. Tuy nhiên các loại vắc-xin sống nhược độc tạo ra bằng cách sử dụngcác tác
nhânlý hóa hoặc bằng phương pháp tiếp truyền truyền thống chỉ giới hạn ở một số
loại mầm bệnh nhất định và nguy cơ các chủng vi khuẩn vắc-xin nhược độc quay
trở lại độc lực cao là rất lớn [18, 28]. Để khắc phục những mặt hạn chế trên, loại
vắc-xin thế hệ mới ra đời, một trong số đó là vắc-xin tái tổ hợp.
Kỹthuật di truyềnđãđược sử dụng để tạo racác sinh vậtcải biến dùng làm
vắc-xin tái tổ hợp sống. Các vắc-xin này là sinh vật không gây bệnh được cải biến
để mang và biểu hiện quyết định kháng nguyên từ tác nhân gây bệnh đích hoặc
chủng cải biến của sinh vật gây bệnh trong đó gen độc đã được cải biến hoặc loại
bỏ. Trongtrường hợp này, như là thành phần của vi khuẩn, các quyết định kháng
nguyên quan trọng có mặt trong hệ miễn dịch có thành phần rất giống với dạng
kháng nguyên ở sinh vật gây bệnh [1].
Gencrp mã hóa CAP-protein hoạt hóa trao đổi chất kết hợp với cAMP tạo
phức cAMP-CAP, phức này liên kết với promoter gây hoạt hóa sao mã các gen cấu
trúc. Thể đột biến gen crpkhông sao mã được mRNA của operon lac, dẫn đến
ix
không tham gia chuyển hóa năng lượng, gây kìm hãm sự sinh trưởng, phát triển của
S. choleraesuis.
Như vậy, việctạo chủng S. choleraesuis mang gen crp bị đột biếnphục vụ cho
việc sản xuấtvắc-xin tái tổ hợp phòng hai bệnh phù đầu và phó thương hàn lợnlà
việc cấp thiết. Do đótôi tham gia thực hiện đề tài “Tạo chủng và kiểm tra đặc tính
sinh hóachủng Salmonella choleraesuisSmith mang gen crpđột biến”.
Mục tiêu của đề tài
-Tạo chủng plasmid pRE112/Δcrp. Chuyển nạp plasmid pRE112/Δcrpvào
chủng S.cholerasuisSmith nhược độc gây đột biến gen crp.
-Kiểm tra đặc tính sinh hóa của chủng S. choleraesuisSmith mang gen crp
đột biến.
Nội dung nghiên cứu
-Tạo dòng plasmid pER112/Δcrp.
-Kiểm tra kết quả tạo dòng plasmid pER112/Δcrp.
-Chuyển nạp plasmid pER112/Δcrp vào chủng S.chorelasuisnhược độc gây
đột biến gen crp.
-Kiểm tra kết quả gây đột biến gen crp.
-Kiểm tra đặc tính sinhhóa của chủng S. choleraesuisnhược độc mang gen
crp bị đột biến.
Ý nghĩa của đề tài
Tạo chủng Salmonella cholerasuisSmith nhược độc mang gen crpđột biến
làm chủng biến nạp để từ đó có thể tiếp tục nghiên cứu sản xuất vắc-xin tái tổ hợp
phòng hai bệnh phù đầu và phó thương hàn lợn.
1
Chương 1. Tổng quan
1.1 Bệnh phó thương hàn lợn
Nền kinh tế phát triển, cùng với hội nhập kinh tế toàn cầu, mức sống của
người dân được nâng cao, vai trò của ngành chăn nuôi trở lên quan trọng,đặc biệt là
ngành chăn nuôi lợn. Ngành chăn nuôi lợn đã góp phần đáp ứng nhu cầu thực phẩm
trong nước và một phần dành cho xuất khẩu thu ngoại tệ. Hiện nay, thịt lợn chiếm
77% tổng lượng các loại thịt tiêu dùng hàng ngày trên thị trường Việt Nam .
Mục tiêu của kế hoạch phát triển chăn nuôi lợn của Việt Nam theo quyết định
của Thủ tướng chính phủ số 10/2008/QĐ-TTg, (2008), chiến lược phát triển chăn
nuôi đến năm 2020: đàn lợntừ 29,9 triệu con năm 2010, lên 32,9 triệu con năm
2015 và lên 34.7 triệu con năm 2020. Sản lượng thịt hơi từ 3.1 triệu tấn năm 2010,
lên 3.9 triệu tấn năm 2015 và 4.8 triệu tấn năm 2020; sản lượng thịt xẻ từ 2191.3
ngàn tấn năm 2010; 2794.7 ngàn tấn năm 2015 và 3493.1 ngàn tấn năm 2020.
Trong đó đàn lợnnuôi công nghiệp 5.8 triệu con (chiếm 19.3%) năm 2010, lên 8.9
triệu con (chiếm 27.0%) năm 2015 và lên 12.9 triệu con (chiếm 37.0%) năm
2020. Sản phẩmthịt hơi nuôi công nghiệp từ 1135.2 ngàn tấn (chiếm 36.5%) năm
2010; 1851.5 ngàn tấn (chiếm 47.2%) năm 2015 và 2866 ngàn tấn (chiếm 59.2%)
năm 2020 .
Để đạt được những mục tiêu có tính chiến lược đó, việcđầu tư cho công tác
nghiên cứu, phát triển giống, thức ăn, xây dựng các chương trình quản lý; đặc biệt
nhiệm vụ của công tác chăn nuôi –thú y càng nặng nề hơn. Trong đó việctăng
cường áp dụng các biện pháp khoa học kỹ thuật cho công tác phòng, chống dịch
bệnh ở lợncó hiệu quảlà điều hết sức quan trọng.
Một thách thức không nhỏ đối với việc phát triển chăn nuôi lợn là dịch bệnh
vẫn thường xuyên xảy ra trên các đàn lợn ở mọi lứa tuổi, làm giảm năng suất, giảm
chất lượng con giống. Sản phẩm thịt lợn nhiễm bệnh làm tăng nguy cơ mất an toàn
vệ sinh thực phẩm. Một trong những bệnh thường gặp phải kể đến là bệnh phó
thương hàn do vi khuẩn Salmonella và phù đầu do vi khuẩn E.coli gây ra.
2
Bệnh phó thương hàn là bệnh truyền nhiễm xảy ra chủ yếu ở lợn 2-4 tháng
tuổi. Bệnh do trực khuẩn Salmonella cholereasuischủng Kunsendorf (thể cấp tính)
và Salmonella typhi suischủng Vondagsen (thể mãntính). Đây là vi khuẩn đường
ruột tác động chủ yếu trên đường tiêu hoá gây ra các triệu chứng và bệnh tích như
viêm ruột, dạ dày, lách sưng to . Các đàn lợn bị nhiễm Salmonellakhông những gây
thiệt hại kinh tế cho người chăn nuôi mà còn là nguồn tàng trữ mầm bệnh gây hại
đối với con người [22, 29].
Hình 1.1Lợn con 3tháng tuổi chết do bị nhiễm S.choleraesuis.
Bệnh xảy ra ở khắp nơi, tạo thành những ổ dịch lẻ tẻ, thường gặp ở những
vùng chăn nuôi có điều kiện vệ sinh kém đặc biệt là vùng sản xuất lợn giống. Ở
nước ta chứng viêm ruột tiêu chảy do Salmonella rất dễ xảy ra trên lợn, bệnh được
phát hiện ở tất cả các tỉnh trong cả nước và gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi.
Khi điều tra tình hình nhiễm vi khuẩn đường ruột ở một số trại chăn nuôi cho thấy:
82-100% số lợn nhiễm vi khuẩn Salmonellavà trên lợn khoẻ cũng mang vi khuẩn
này với một tỷ lệ nhất định[6]. Phân lập vi khuẩn từ phân lợn tiêu chảy cũng cho


TÀI LIỆU THAM KHẢO
TIẾNG VIỆT
1. Bernard R. Glick, Jack J. Pasternak, Cheryl L. Patten, Công nghệ sinh học
phân tử -Nguyên lý và ứng dụng của ADN tái tổ hợp, Nxb KHKT.
2. Đào Trọng Đạt, Phan Thanh Phượng (1986), Bệnh gia súc non tập II, NXB
NN, Hà Nội.
3. Hoàng Trọng Phán, giáo trình “Di truyền học”,Đại học Huế.
4. Nguyễn Như Thanh (2001), Vi sinh vật thú y, NXBNông nghiệp, Hà Nội.
5. Nguyễn Như Thanh, Nguyễn Bá Hiên, Trần Thị Lan Hương (1997), Vi sinh
vật thú y, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
6. Nguyễn Thị Nội, Nguyễn Ngọc Nhiên, Cù Hữu Phú, Nguyễn Thị Sở, Trần
Thị Thu Hà (1989), Kết quả điều tra về tình hình nhiễm vi khuẩn đường ruột
tại một số cơ sở chăn nuôi lợn, tuyển tập Kết quả nghiên cứu khoa học và kỹ
thuật thú y 1985-1989, NXB Nông nghiệp, Hà Nội 1989.
7. PGS.TS. Nguyễn Như Thanh, (2001), Vi sinh vật thú y, NXB Nông Nghiệp
Hà Nội.
8. Phùng Quốc Chướng (1995), Tình hình nhiễm Salmonella ở lợn vùng Tây
Nguyên và khả năng phòng trị, Luận án PTS KHNông Nghiệp, Hà Nội.
9. Vũ Bình Minh, Cù Hữu Phú (1999), Kết quả phân lập vi khuẩn E.colivà
Salmonella ở lơn mắc bệnh tiêu chảy, xác định một số đặc tính sinh vật hóa
học của các chủng vi khuẩn phân lập được, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y,
tập 6–Hội thúy Việt Nam, Hà Nội
52
TIẾNG ANH
10. Chen Z.W., Hsuan S.L., Liao J.W., Chen T.H., Wu C.M., Lee W.C., Lin
C.C., Liao C.M., Yeh K.S., Winton J.R., Huang C, Chien M.S., (2010),
Mutations in the Salmonella enterica serovar Choleraesuis cAMP-receptor
protein gene lead to functional defects in the SPI-1 Type III secretion system,
Vet Res, (41), 1-5.
11. Chu C.Y., Wang S.Y., Chen Z.W., Chien M.S., Huang J.P., Chen J.J., et al.,
(2007), Heterologous protection in pigs induced by a plasmid-cured and crp
gene-deleted S.choleraesuislive vaccine, Vaccine, (25), 7031–7040.
12. Chuan Y.U.et al., (2010), Construction and Characterization of a
S.choleraesuisC78-1 crp Deletion Mutant, Acta Veterinaria et
Zootechnica Sinica, 41 (5).
13. Dean A G., Ching Y.C., Williams and Harden L.B.(1972), “Test for E.coli
Enterotoxin using infant mice”, J. Infect, Dis,125(4): 407-11.
14. Gao H., Zhang Y., YangL., Liu X., Guo Z., Tan Y., Han Y., Huang X.,
Zhou D., Yang R.,.(2011), Regulatory effects of cAMP receptor protein
(CRP) on porin genes and its own gene in Yersinia pestis, Beijing Institute of
Microbiology and Epidemiology, Beijing 100071, PR China.
15. Hackett J., (1990), Salmonella-based vaccines,Vaccine,8(1): 5-11.
16. Kang H.Y., Dozois C.M., Tinge S.A., Lee T.H., Curtiss R., (2002),
Trasduction-mediated transfer of unmarked delection and point mutations
through use of counterselectable suicide vector, 184(1): 307-12
17. Kennedy M.J., Yancey R.J. Jr, Sanchez M.S., Rzepkowski R.A., Kelly S.M.,
Curtiss R. III, (1999), Attenuation and immunogenicity of cya crp
derivatives of S.choleraesuisin pigs, Infect Immun, (67), 4628-4636.
53
18. MoosM , (1995), Models of risk assessments for biologicals or related
products in the European Union, Revue Scientifique et
19. Morris I.A, Way C., Sojka W.J.(1976), “The effect of T and B lymphocyte
depletion on the protection of mice vaccinated with a gel Emutant of
Salmone.la typhimurium”, Bristh J. of Exp.
20. Salmon, D. E. And Smith. 1885. Report on swine plague. U.S. Bureau of
Animal Industies, 2nd Annual Report, U.S. Government Printing Office,
Washington, DC.
21. Sandefur P.D., Peterson J.W.(1977), Neutralization of Salmonella Toxin-induced elongation of chinese-hamster-ovary cell choleranti Toxin, Ibid,Vol
1.
22. Schwartz K.J., Salmonellosis, Straw B.E., D’Allaire S., Mengeling W.,
Taylor D.J. (Eds.), (1999), Disease of swine, Iowa State University Press,
Ames.
23. Sedlock D.M., Deibel R.H.(1978), Dectection of Salmonella typhimurium
EnteroToxin using rabbit iieal loops,Can.J.Microbiol.
24. Sedlock D.M., Koupal B.N., Deibel R.H.(1978), Production and partial
purification of Salmonella eteroToxin,J.Immun, Vol 20.
25. Simone Oliveria, University of Minnesota, November 9, 2010, Development
and validation of molecular-based tools to differentiate attenuated
Salmonella choleraesuis vaccine strains from field isolates - NPB #: 09-094.
26. Busby S., Ebright R.H.,(1999), Transcription Activation by Catabolite
Activator Protein (CAP), 293(2): 199-213.
27. Taylor,Wilkins (1961), The effects of Salmonella and Shigellaon the
ligated loops of rabbits gut, India J.Med.Res.
28. Terpstra, C., Kroese, A.H., (1996), Potency control of modified live viral
vaccines for veterinary use, Vaccine,14(1), 13-18.
54
29. Wegener, M., Bruckner, L., Cubetaler, K., (1998), The establishment of
endotoxin limits which satisfy animal welfare considerations in the testing of
provine vaccine, ALTEX: Alternativen zu Tierexperimenten.
30. Xu Y.D.et al., (2006), Construction and characterization of delta crp delta
asd mutant host-vector balanced lethal system of S.choleraesuisC500 strain,
22(3): 366-72.