Thạc Sĩ Tạo chủng Edwardsiella ictaluri đột biến gen wzz bằng phương pháp knockout gen wzz

MỞ ĐẦU

Cá tra (Pangasius hypophthalmus) là loài cá có tiềm năng xuất khẩu lớn và mang lại lợi nhuận cao cho người nuôi. Theo Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu thuỷ sản Việt Nam (The Vietnam Association of Seafood Exporters and Producers – VASEP), sản phẩm cá tra Việt Nam đang dẫn đầu thị phần thế giới (2009). VASEP dự báo, vị trí dẫn đầu thị trường thế giới của Cá tra Việt Nam sẽ còn giữ vững trong nhiều năm tới. Với tiềm năng kinh tế lớn như vậy, cá tra hiện là một trong những sản phẩm xuất khẩu chủ lực của Việt Nam. Theo quy hoạch của Bộ Nông Nghiệp & Phát Triển Nông Thôn, đến năm 2010 sản lượng cá tra là 1,5 triệu tấn, đạt kim ngạch xuất khẩu 1,5 tỉ USD và đến năm 2020, sản lượng ước đạt 2 triệu tấn, kim ngạch xuất khẩu 2 tỷ USD.
Một trong những giải pháp quan trọng để nâng cao sản lượng cá tra là nuôi công nghiệp tập trung với quy mô lớn. Tuy nhiên, việc nuôi cá với mật độ cao tạo điều kiện cho các bệnh nhiễm khuẩn phát triển và lây lan như bệnh mủ gan, bệnh đốm đỏ, bệnh do nấm, kí sinh trùng Trong đó, đã và đang gây thiệt hại nghiêm trọng nhất là bệnh gan thận mủ do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra. Khi cá bị nhiễm bệnh, tỷ lệ chết có thể lên đến 90%. Để điều trị bệnh, người nuôi thường sử dụng thuốc hóa học và một số loại kháng sinh. Tuy nhiên, việc sử dụng thuốc và hóa chất không đúng qui định và lặp đi lặp lại trong thời gian dài đã dẫn đến tình trạng kháng thuốc và hiệu quả không cao. Hơn nữa, lượng tồn dư kháng sinh trong cá không chỉ ảnh hưởng tới chất lượng của sản phẩm, mà còn ảnh hưởng đến sức khỏe của người tiêu dùng. Để giải quyết vấn đề trên, biện pháp sử dụng vaccine phòng bệnh được đánh giá là có hiệu quả, ít tốn kém và đảm bảo an toàn sinh học. Do đó, việc tìm kiếm các loại vaccine cho cá tra kháng lại các bệnh nhiễm khuẩn đang là vấn đề cấp bách cho công nghiệp nuôi cá tại Việt Nam. Đối với vi khuẩn E. ictaluri, O antigen được chứng minh là một kháng nguyên mạnh và là yếu tố gây độc quan trọng. Chiều dài chuỗi O antigen được điều hòa bởi gen wzz (length chain determinant gene). Nghiên cứu ở các loài vi khuẩn Gram âm khác như E. coli, Samonella, Yersinia cho thấy khi chủng vi khuẩn đột biến gen wzz thì O antigen sẽ phân bố chiều dài chuỗi một cách ngẫu nhiên và có độc tính thấp hơn so với chủng hoang dại.
Từ những thực tiễn nêu trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Tạo chủng Edwardsiella ictaluri đột biến gen wzz bằng phương pháp knockout gen” nhằm làm cơ sở cho việc sản xuất vaccine nhược độc phòng bệnh cho cá tra.
Mục tiêu của đề tài
- Tạo chủng E. ictaluri đột biến gen wzz bằng phương pháp knockout gen.
Nội dung đề tài bao gồm
- Tạo dòng đoạn gen wzz của E. ictaluri trong E. coli DH5α.
- Tạo chủng E. ictaluri mang plasmid pKD46.
- Tạo chủng E. ictaluri đột biến gen wzz bằng phương pháp 1 STEP.
- Tạo chủng E. ictaluri đột biến gen wzz bằng phương pháp 2 STEP.
- Tạo chủng E. ictaluri đột biến gen wzz bằng phương pháp sử dụng suicide plasmid pGP704.
- Loại bỏ plasmid pKD46 ra khỏi chủng E. ictaluri đột biến gen wzz
MỤC LỤC

MỤC LỤC i
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT viii
DANH MỤC CÁC BẢNG ix
DANH MỤC CÁC HÌNH x
DANH MỤC SƠ ĐỒ xiv
MỞ ĐẦU 1
Chương 1 – TỔNG QUAN
1.1. Sơ lược về vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh mủ gan trên
cá tra 3
1.2. Tình hình nghiên cứu vaccine cho cá kháng vi khuẩn Edwardsiella
ictaluri 4
1.2.1. Những nghiên cứu trên thế giới . 4
1.2.2. Những nghiên cứu ở Việt Nam 6
1.3. Lipopolysacharide (LPS) và vai trò của gen wzz trong quá trình tổng hợp LPS . 7
1.3.1. Cấu trúc và chức năng của LPS . 7
1.3.2. Quá trình tổng hợp LPS và vai trò của gen wzz . 9
1.3.3. Một số nghiên cứu về gen wzz 11
1.4. Phương pháp knockout gen sử dụng hệ thống tái tổ hợp tương đồng λ Red 12
1.5. Tạo chủng E. icataluri đột biến gen wzz bằng phương pháp knockout gen và triển vọng làm vaccine 13
Chương 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Thiết bị, hóa chất, vật liệu 15
2.1.1. Thiết bị và dụng cụ 15
2.1.2. Hóa chất . 15
2.1.2.1. Hóa chất dùng để tách chiết plasmid 15
2.1.2.2. Hóa chất dùng để tinh sạch sản phẩm PCR 15
2.1.2.3. Hóa chất dùng để tách chiết DNA từ gel agarose . 16
2.1.2.4. Hóa chất dùng cho phản ứng cắt giới hạn 16
2.1.2.5. Hóa chất dùng cho phản ứng PCR . 16
2.1.2.6. Hóa chất dùng cho điện di DNA . 16
2.1.2.7. Thang DNA 17
2.1.2.8. Hóa chất dùng cho chuẩn bị tế bào khả nạp bằng phương pháp
hóa biến nạp . 17
2.1.2.9. Hóa chất dùng cho chuẩn bị tế bào khả nạp bằng phương pháp
điện biến nạp . 17
2.1.3. Môi trường 18
2.1.3.1. Môi trường LB (Luria Bertami) . 18
2.1.3.2. Môi trường BHI (Brain Heart Infusion) 18
2.1.4. Chủng vi sinh vật . 18
2.1.5. Plasmid 18
Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Thạc sĩ Sinh học
iii
2.1.5.1. Plasmid pKD4 18
2.1.5.2. Plasmid pCAMBIA 1300 19
2.1.5.3. Plasmid pGEM-T Easy . 20
2.1.5.4. Plasmid pJET1.2/blunt . 20
2.1.5.5. Plasmid pKD46 21
2.1.5.6. Plasmid pGP704 22
2.2. Phương pháp nghiên cứu . 23
2.2.1. Tạo dòng E. coli DH5α mang đoạn gen wzz của E. ictaluri . 23
2.2.1.1. Thiết kế mồi 23
2.2.1.2. Khuếch đại và thu nhận đoạn gen wzz của E. ictaluri . 23
2.2.1.3. Phản ứng nối tạo plasmid tái tổ hợp pGEM-T Easy mang đoạn gen wzz (pGEMT::wzz) 24
2.2.1.4. Chuẩn bị tế bào khả nạp E. coli DH5α bằng phương pháp hóa biến nạp 24
2.2.1.5. Biến nạp plasmid tái tổ hợp pGEM-T::wzz vào E. coli DH5α . 25
2.2.1.6. Kiểm tra dòng biến nạp bằng PCR khuẩn lạc . 25
2.2.1.7. Kiểm tra dòng biến nạp bằng phản ứng cắt giới hạn 26
2.2.1.8. Giải trình tự gen wzz 26
2.2.2. Tạo chủng E. ictaluri mang plasmid pKD46 27
2.2.2.1. Chuẩn bị tế bào khả nạp E. ictaluri bằng phương pháp điện biến nạp 27
2.2.2.2. Biến nạp plasmid pKD46 vào E. ictaluri . 27
2.2.2.3. Kiểm tra dòng tế bào E. ictaluri mang pKD6 bằng phản ứng cắt giới hạn . 28
2.2.2.4. Chuẩn bị tế bào khả nạp E. ictaluri mang plasmid pKD46 bằng phương pháp điện biến nạp 28
2.2.3. Knockout gen wzz bằng phương pháp 1 STEP . 29
2.2.3.1. Thiết kế mồi 29
2.2.3.2. Phản ứng PCR tạo cassette 1 STEP 30
2.2.3.3. Biến nạp cassette 1 STEP vào E. ictaluri mang pKD46 . 30
2.2.4. Knockout gen wzz bằng phương pháp 2 STEP . 30
2.2.4.1. Thiết kế mồi 32
2.2.4.2. Phản ứng PCR tạo cassette 2 STEP 32
2.2.4.3. Biến nạp cassette 2 STEP vào E. ictaluri mang pKD46 . 33
2.2.5. Knockout gen wzz bằng phương pháp sử dụng suicide plasmid pGP704 . 34
2.2.5.1. Tạo dòng E. coli DH5α chứa plasmid pJET1.2/blunt mang đoạn đầu của gen wzz . 35
2.2.5.2. Tạo dòng E. coli DH5α chứa plasmid pJET1.2/blunt mang đoạn cuối của gen wzz 37
2.2.5.3. Tạo dòng E. coli DH5α chứa plasmid pJET1.2/blunt mang đoạn đầu (Hwzz) và đoạn cuối (Twzz) của gen wzz . 38
2.2.5.4. Tạo dòng E. coli DH5α chứa plasmid pJET1.2/blunt mang đoạn gen kháng kanamycin từ pCAMBIA 1300 40
2.2.5.5. Tạo dòng E. coli DH5α mang plasmid chứa cassette HTK (pJET::HTK) . 42
2.2.5.6. Tạo dòng tế bào E. coli DH5α λpir mang plasmid tái tổ hợp pGP704::HTK 43
2.2.5.7. Biến nạp plasmid tái tổ hợp pGP704::HTK vào E. ictaluri::pKD46 để tạo chủng E. ictaluri đột biến gen wzz 45
2.2.5.8. Tạo dòng E. coli SM10 λpir chứa plasmid tái tổ hợp pGP704::HTK 45
2.2.5.9. Tạo chủng E. ictalruri đột biến gen wzz bằng phương pháp tiếp hợp 46
2.2.6. Loại bỏ plamid pKD46 ra khỏi chủng E. ictaluri đột biến gen wzz 47
Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.1. Nuôi cấy chủng E. ictaluri hoang dại 48
3.2. Tạo dòng E. coli DH5α mang đoạn gen wzz của E. ictaluri . 49
3.2.1. Khuếch đại và thu nhận đoạn gen wzz của E. ictaluri 49
3.2.2. Kết quả nhân dòng gen wzz trong E. coli DH5α bằng vector pGEM-T Easy 50
3.3. Tạo chủng E. ictaluri mang plasmid pKD46 . 53
3.4. Knockout gen wzz bằng phương pháp 1 STEP 54
3.4.1. Phản ứng PCR tạo cassette 1 STEP 54
3.4.2. Biến nạp cassette 1 STEP vào E. ictaluri mang pKD46 để tạo chủng E. ictaluri đột biến gen wzz 55
3.5. Knockout gen wzz bằng phương pháp 2 STEP . 55 3.5.1. Phản ứng PCR tạo cassette 2 STEP 55
3.5.2. Biến nạp cassette 2 STEP vào E. ictaluri mang pKD46 để tạo chủng E. ictaluri đột biến gen wzz . 57
3.6. Knockout gen wzz bằng phương pháp sử dụng suicide plasmid pGP704 58
3.6.1. Tạo dòng E. coli DH5α chứa plasmid pJET1.2/blunt mang đoạn đầu của gen wzz 58
3.6.1.1. Khuếch đại và thu nhận đoạn đầu gen wzz . 58
3.6.1.2. Nhân dòng đoạn đầu của gen wzz trong E. coli DH5α bằng vector pJET1.2/blunt 59
3.6.2. Tạo dòng E. coli DH5α chứa plasmid pJET1.2/blunt mang đoạn cuối của gen wzz . 61
3.6.2.1.Khuếch đại và thu nhận đoạn cuối gen wzz 61
3.6.2.2. Nhân dòng đoạn cuối của gen wzz trong E. coli DH5α bằng vector pJET1.2/blunt 62
3.6.3. Tạo dòng tế bào E. coli DH5α chứa plasmid pJET1.2/blunt mang đoạn đầu và đoạn cuối của gen wzz 64
3.6.4. Tạo dòng E. coli DH5α chứa plasmid pJET1.2/blunt mang đoạn gen kháng kanamycin từ pCAMBIA 1300 66
3.6.4.1. Khuếch đại và thu nhận đoạn gen kháng kanamycin từ pCAMBIA 1300 . 66
3.6.4.2. Nhân dòng đoạn gen kháng kanamycin trong E. coli DH5α bằng vector pJET1.2/blunt . 67
3.6.5. Tạo dòng E. coli DH5α chứa plasmid pJET1.2/blunt mang cassette HTK (pJET::HTK) . 69
3.6.6. Tạo dòng tế bào E. coli DH5α λpir mang plasmid tái tổ hợp pGP704::HTK . 71
3.6.7. Biến nạp plasmid tái tổ hợp pGP704::HTK vào E. ictaluri::pKD46 để tạo chủng E. ictaluri đột biến gen wzz . 73
3.6.8. Tạo dòng E. coli SM10 λpir chứa plasmid tái tổ hợp pGP704::HTK . 77
3.6.9. Tạo chủng E. ictalruri đột biến gen wzz bằng phương pháp tiếp hợp . 78
3.7. Loại bỏ plamid pKD46 ra khỏi chủng E. ictaluri đột biến gen wzz 82
Chương 4 – KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
4.1. Kết luận . 83
4.2. Đề nghị . 83
TÀI LIỆU THAM KHẢO 84
PHỤ LỤC 89