Luận Văn Tăng biểu hiện gene ALKB1, ALKB2, mã hoá enzyme N-Alkane monooxygenase ở Rhodococcus opacus B4

Ngày nay, các công nghệ sản xuất các hóa chất có giá trị thương mại từ các chất
không tan trong nước như các hydrocarbon từ nguồn dầu mỏ bằng xúc tác sinh học
đang rất được quan tâm. Các tế bào thường được sử dụng làm xúc tác sinh học vì có
sẵn các cofactor (NADH, ) và có khả năng tái tạo các cofactor này. Khả năng tái tạo
các cofactor của tế bào rất cần thiết cho các phản ứng oxy hóa và khử. Trong ngành
công nghệ hóa chất, nguyên liệu để tổng hợp hóa chất thường không phân cực như các
hydrocarbon trong dầu mỏ và các dẫn xuất của chúng. Các nguyên liệu này và các sản
phẩm tạo thành có độc tính cao đối với các xúc tác sinh học và làm giới hạn việc ứng
dụng xúc tác sinh học trong ngành công nghiệp hóa chất. Giải pháp cho vấn đề này là
phải sử dụng các vi sinh vật chủ (host strain) có khả năng chịu được các dung môi hữu
cơ làm xúc tác sinh học.
Rhodococcus opacus B4 thâm chi co thê sông, sinh trương tôt va co thê xuc tac
nhiều phản ứng sinh tổng hợp trong môi trương thâm chi chi co dung môi hưu cơ nên
là đối tương đang rât đươc quan tâm . Và trong các phản ứng mà nó xúc tác , phản ứng
chuyên đôi n- alkane đong môt phân quan trong.
1.2. Mục đích và yêu cầu
1.2.1. Mục đích
Tạo chủng R. opacus có biểu hiện gene alkB cao hơn chủng bình thường, nhằm
phục vụ cho sản xuất hóa chất bằng xúc tác sinh học sau này.
1.2.2. Yêu cầu
Tạo chủng R. opacus có năng suất chuyển hóa n- alkane cao hơn chủng bình
thường.

PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tâm quan trong cua san xuât hoa chât băng sinh vât
2.2. Giới thiệu chung
Loài vi khuân Rhodococcus. spp đươc Zopf đề cập lần đầu tiên vao năm 1891,
là loài vi khuân mang săc tô đo, quan trong vê măt thu y, bênh ly, công nghiêp. Hâu
hêt họ rhodococci (ngoại trư R. equi là nguồn gây bệnh trên thú và người ) có tiềm
năng thương mai cao do co khả năng tạo nhiều chất hoạt tính bề mặt – acid mycolic –
và có hệ thống enzyme có tác dụng chuyển hóa và phân hủy sinh học . Rhodococcus
opacus B4, được phân lập từ vùng đất nhiễm dầu, là đối tượng lý tưởng dùng trong
phân huy sinh hoc cac loai hydrocarbon vi nó có thể phân hủy nhiều loại hợp chất hữu
cơ phô biên trong môi trường, bề mặt vi khuẩn có tính kỵ nước và hấp thụ nguồn
hydrocarbon bằng cách tạo các chất hoạt hóa bề mặt nên chịu được nhiều loại dung
môi hữu cơ khác nhau.
Hiên nay, viêc sư dung hê thông oxy hoa alkane cua vi khuân lam xuc tac sinh
học trong sản xuất hóa chất và dươc phâm rât đươc quan tâm . Các phản ứng sinh học
này thu hút nhiều sự quan tâm vì việc đưa nguyên tử [O] vào các hóa chất bất h oạt
như alkane băng con đương hoa hoc cô điên co nhiêu kho khăn . Môt phân vi cac chât
oxy hóa mạnh cần để kích h oạt nguyên tư C thương không tương thich vơi cơ chât .
Phân khac vi thương tao ra cac sa n phâm oxy hoa phu khac thông qua cac phan ưng
phụ.
Tính kỵ nước của vi khuẩn giúp bảo vệ vi khuẩn khỏi độc tính của các hợp chất
tan trong nươc . Ch̉ có Rhodococcus có thể chịu được nông đô cao chât hưu cơ tan .
Hơn nưa, lipid hoat hoa bê măt rhodococci góp phần tạo khả năng trao đổi alkane.
Sư trao đôi alkane đươc ma hoa chu yêu bơi gene alkane hydroxylase (alk)
được bảo tồn trong nhiều l oài vi khuân. AlkB co tinh bao tôn cao va co nhiêu ph iên
bản nên biểu hiện của mỗi loại alkB được điều khiển bởi mỗi loại nhân tố phiên mã
khác nhau. Cho đên nay, người ta đa biêt đên 60 dạng alkB co trinh tư rât đa dang.
Alkane chiêm tư 20 – 50% trong thanh phân dâu thô , phụ thuộc vào nguồn dầu .
Tuy nhiên, nhiêu loại sinh vât như vi khu ẩn, cây côi va môt sô l oài đông vât cung san
sinh ra alkane. Alkane trơ vê măt hóa học và phải được hoạt hóa trước khi chuyển hóa.
Khi co măt oxygen , phản ứng oxy hóa thư ờng bắt đầu từ oxy hóa nhóm methyl cuối
cùng tạo n- alcohol va sau đo qua trinh oxy hoa tiêp tuc bơi enzyme dehydrogenase để
tạo acid béo tương ứng.
Môt vai loài vi khuân chi co môt loai alkane hydroxylase, trong khi môt sô
loài khác có nhiêu dang alkane hydroxylase hơn. Các l oại alkane hydroxylase này
thường có dạng cơ chất tương tự nhau , ch̉ khác nhau là chúng được tạ o ra ở phase ôn
đinh ban đâu hay phase tăng trương trong giai đoạn sinh trương cua vi khuân (17).
Hầu hêt cac l oài vi khuân co kha năng chuyên hoa chuỗi alkane dài hơn 10
nguyên tư C (C12 tơi C20 hay thâm chi C30). Trong khi rât nhiêu loai vi sinh vâ t co kha
năng sư dung alkane co chuôi C dai , dạng thê lỏng thi môt sô l oài vi khuân Gram (+)
như Corynebacterium – Nocardia – Mycobacterium – Rhodococcus ch̉ có thể chuyên
hóa các alkane chuôi ngăn, dạng thể khí.
AlkB1, alkB2 là các gene có sẵn trong genome của R. opacus B4, mã hóa cho
enzyme n- alkane monooxygenases (2 enzyme liên kết với màng tế bào), có tác dụng
xúc tác quá trình oxy hóa nhóm methyl cuối cùng trong mạch carbon của n- alkane để
tạo alcohol, aldehyde và acid béo (các hợp chất hữu cơ quan trọng trong ngành công
nghiệp hóa chất). Alcohol, aldehyde và acid béo là các loại hóa chất rất quan trọng
trong các quá trình sản xuất và trong đời sống hằng ngày. Nhưng để sản xuất các chất
này bằng con đường hóa học phải cần qui trình sản xuất ở nhiệt độ và áp suất cao.
Nhân tô chinh va qu an trong nhât đê co thê giam chi phi cua t oàn bô qui trinh
sản xuất là chi phí xúc tác sinh học , quyêt đinh bơi gia ca cua môi trương va nguôn C
dùng cho tế bào , hoạt tính và tính ổn định của xúc tác sinh học trong đi ều kiện sản
xuât. Nêu hoạt tính xúc tác sinh học gấp đ ôi va ôn đinh se giam t oàn bô chi phi cua
quá trình đến 5,7 USD/kg (đôi vơi fed – batch) và 5,9 USD/kg (đôi vơi qui trinh san
xuât liên tục). Vì vậy việc tăng hoạt tính của enzyme đóng vai trò rất quan trọng.
2.3. Giới thiệu về Rhodococcus opacus B4
Tư trươc đên nay, họ rhodococci rât it đươc quan tâm vì nhiều lý do. Môt trong
nhưng ly do đo la ho vi khuân nay sinh trương châm , khó phân lập và thiế u dâu hiêu
để nhận biết có phải là nguồn gây bệnh hay không . Gân đây, họ vi khuẩn này đang là
đôi tương nghiên cưu trên nhiêu quôc gia . Môt trong nhưng nghiên cứu là ứng dụng
chúng vào biến đổi hóa học và sinh tổng hợp các hơp chât hữu cơ.
R. opacus chiêm phân lơn trong quân thê vi sinh vât sông trong đât . R. opacus
có thể sống ở 33oC, nhưng không thể sống ở 42oC, có thể sống ở nhiệt độ thấp
(4 – 10oC) và trong kh oảng pH rông (5 – 9). Rhodococcus opacus có nhiễm sắc thể
dạng thẳng và các plasmid dạng thẳng , có kích thước rất lớn, có thể sử dụng nhiều loại
chât hưu cơ lam nguôn hydrocarbon như benzene , toluene, napthalene, n- alkane .
Khi co măt n- alkane , rhodococci tạo ra 1 loại saccharide ngoại bào gọi là EPS
(extra cellular polysaccharides ), phát triển cấu trúc màng nội bào , cũng như tăng
cương phat triên vach tê bao (Ivshina và ctv, 1982; Glazacheva và ctv, 1990). Khi tăng
trương trên n- alkane lỏng, rhodococci có khả năng tông hơp cac chât h oạt tính bề mặt
giúp giảm đô căng bê măt cua nươc , tạo thể sữa và có nhiều ưu điểm trong việc tổng
hơp cac chât tây rưa. Các chất hoạt tính bề mặt từ rhodococci ít độc hại hơn 100 lân so
vơi cac chât tây rưa tông hơp khac.
Rhodococci rât đươc quan tâm vê măt sinh thai va ca vê măt công nghiêp vi
chúng có khả năng tổng hợp cá c acid ngoai bao , bao gôm các acid amine thiết yếu khi
phát triển trên n- alkane.

PHẦN 6: TÀI LIỆU THAM KHẢO
1) Differential expression of the components of the 2 alkane hydroxylases from
Pseudomonas aeruginosa.
2) Chracterization of 2 alkane hydroxylase genes from the marine
hydrocarbonnoclastic bacterium Alcanivorax borkumensis.
3) Isolation and phenotypic and molecular characterization of hydrocarbon-degrading
bacteria isolated from Terra Nova Bay (Antarctica).Dep. of Animal Biology and
Genetics, Univ. of Florence.Dep. of Animal Biology and Marine Ecology,Univ. of
Messina,Italy.
4) Recent Advances in Petroleum Microbiology. MICROBIOLOGY AND
MOLECULAR BIOLOGY REVIEWS, Dec. 2003, p. 503–549 092-
2172/03/$08.000 DOI: 10.1128/MMBR.67.4.503–549.2003.
5) Na,K.S., Nagayasu, K., Kuroda,A., Takiguchi, N., Ikeda,T., Ohtake,H., and
Kato,J : Isolation and characterization of benzene-tolerant Rhodococcus opacus
strains. J.Biosci. Bioeng., 99,378-382 (2005).
6) Na,K.S., Nagayasu, K., Kuroda,A., Takiguchi, N., Ikeda,T., Ohtake,H., and
Kato,J : Development of a genetic transformation system for benzene- tolerant
Rhodococcus opacus strains. J.Biosci. Bioeng., 99,408-414 (2005).
7) Functional analysis of alkane hydroxylases from Gram-negative and Gram-positive
bacteria. J.Bacteriology., v184,No6.
8) Schmid, J.S.Dordick, B.Hauer, A.Kiener, M.Wubbolts, B.Witholt. Industrial
biocatalysis today and tomorrow. Nature. V409.11/Jan/2001.
9) Eva J.Mckenna, Minor J.Coon. Enzymatic w-oxidation. IV. Purification and
properties of the w-hydroxylase of Pseudomonas olevorans. J.Biological
Chemistry,v245., No15 , 3882-3889, 1970.
10) Renata G.Mathys, Oemer M.Kut, Bernard Witholt . Alkanol removal from the
apolar phase of a two-liquid phase bioconversion system. Part I : comparison of a
less volatile and a more volatile in-situ extraction solvent for the separation of 1-
octanol by distillation. J.chem.Technol.Biotechnol.1998, 71, 315-325.
11) Renata G.Mathys, Oemer M.Kut, Bernard Witholt. Integrated two-liquid phase
bioconversion and product-recovery processes for the oxidation of alkanes :
process design and economic evaluation.
12) T.Kotani, T.yamamoto, H.Yurimoto, Y. Sakai, N.Kato. Propane
monooxygenase and NAD+
- dependent secondary alcohol dehydrogenase in
propane metabolism by Gordonia sp. Strain TY-5. J.Bacteriology, Dec.2003, 7120-
7128.
13) Sakai, Y., J.H. Maeng, S.Kubota, A. Tani, Y.Tani, N.Kato. 1996. A non-
conventional dissimilation pathway for long chain n- alkanes inn Acinetobacter sp.
M-1 that start with a dioxygenase reaction. J.Ferment. Bioeng.81:286-291.
14) Whyte, L.G.,T.H. Smits, D.Labbe, B.Witholt, C.W.Greer, J.B.vanBeilen,
2002, Gene cloning and characterization of multiple alkane hydroxylase systems in
Rhodococcus strain Q15 and NRRLB-16531. Appl. Environ. Microbiol. 68:5933-
5942.
15) M.Nieboer, A. Vis, B.Witholt. 1996. Overproduction of a foreign membrane
protein in Escherichia coli stimulates and depends on phospholipids synthesis.
J.Biochem. 241, 691-696.
16) Mycobacterium sp., Rhodococcus erythropolis, and Pseudomonas putida behavior
in the presence of organic solvents. 2004. Microscopic research and technique.
17) Specificity at the end of the tunnel : Understanding substrate length discrimination
by the alkB Alkane Hydroxylase.
18) Determination of the presence of the catabolic alkane monooxygenase gene from
soil microorganisms isolated from coastal sand dunes. 2000.
19) van Beilen,J.B., M. Wubbolts, Q. chen, M.Nieboer, and B.Witholt, 1996.
Effects of two-liquid-phase systems and expression of alk genes on the physiology
of alkane-oxidizing strains, p. 35-47. In T. Nakazawa, K. Furukawa, D. Haas, and
S. Silver (ed.), Molecular biology of Pseudomonas , ASM Press, Washington, D.C.
20) Witholt, B., M.J. de Smet, J.B. Kingma, J.B. van Beilen, M. Kok,
R.G.Lageveen, and G.Eggpink. 1990. Bioconversions of aliphatic compounds by
Pseudomonas oleovorans inn multiphase bioreactors: background and economic
potential. Trends Biotechnol. 8:46-52.
21) Biotransformation of D-limonene to (+)trans-carveol by toluene –grown R.opacus
PWD4 cells.
22) Daniel J.Arp. Butane metabolism by butane-grown „Pseudomonas butanovora‟ .
Microbio (1999), 145, 1173-1180.
23) Hara, S.Baik, K. Syutsubo, N.Misawa, H. M. Smits, Jan B. van Beilen,
S.Harayama. Env.Microbio. (2004)6(3), 191–197. Cloning and functional analysis
of alkB genes in Alcanivorax borkumensis SK2.
24) Surface-active lipids in rhodococci. Antonie van Leeuwenhoek 74: 59-70, 1998.
25) Improving enzymes by using them in organic solvents. Nature .V.409.11Jan, 2001.

MỤC LỤC
TRANG
Trang tựa
Lời cảm ơn . iii
Tóm tắt khóa luận . iv
Mục lục v
Danh sách các hình vii
Danh sách sơ đồ và bảng . viii
1. MỞ ĐẦU . 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục đích và yêu cầu 1
1.2.1. Mục đích 1
1.2.2. Yêu cầu 1
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2
2.1. Tầm quan trọng của sản xuất hóa chất bằng sinh vật 2
2.2. Giới thiệu chung về loài vi khuẩn Rhodococcus . 3
2.3. Giới thiệu về Rhodococcus opacus B4 5
2.4. N- alkane monooxygenase 8
3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 11
3.1. Thời gian và địa điểm 11
3.2. Vật liệu 11
3.2.1. Chủng vi khuẩn và phương pháp nuôi cấy 11
3.2.2. Plasmid 11
3.2.3. PCR primers 11
3.2.4. Môi trường . 12
3.3. Chiến lược thí nghiệm tổng quát . 14
3.4. Phương pháp 15
3.4.1. Kỹ thuật . 15
3.4.1.1. PCR 15
3.4.1.2. Thiết kế mồi . 15
3.4.1.3. Sắc ký khí 16
3.4.2. Phương pháp 18
3.4.2.1. Phân lập Rhodococcus opacus B4 . 18
3.4.2.2. Phương pháp khuếch đại đoạn gene bằng PCR . 18
3.4.2.3. Phương pháp tách plasmid từ vi khuẩn . 18
3.4.2.4. Ligation vào T- vector . 19
3.4.2.5. Kỹ thuật blunt-end . 19
3.4.2.6. Chuyển nạp bằng phương pháp shock nhiệt 19
3.4.2.7. Điện chuyển . 20
3.4.2.8. Xác định hoạt tính enzyme 20
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 22
4.1. Kết quả . 22
4.2. Thảo luận . 24
5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 27
5.1. Kết luận 27
5.2. Đề nghị 27
6. TÀI LIỆU THAM KHẢO . 28