Luận Văn Tách chiết, tinh sạch và tính chất của protease từ nội tạng và đầu tôm sú (Penaeus monodon)

TÓM TẮT KHÓA LUẬN
​

Nguyễn Văn Nam, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 08/2007. “TÁCH CHIẾT, TINH SẠCH VÀ TÍNH CHẤT CỦA PROTEASE TỪ NỘI TẠNG VÀ ĐẦU TÔM SÚ (Penaeus monodon)”. Hội đồng giáo viên hướng dẫn:
 PGS-TS. Nguyễn Tiến Thắng.
 Ths. Nguyễn Lệ Hà.
Để hiểu biết về tính chất và sự biến đổi của hệ protease nhằm có những biện pháp bảo quản hữu hiệu trong chế biến nguyên liệu tôm sau khi thu hoạch và tận dụng triệt để nguồn phế phụ phẩm của tôm để thu chế phẩm protease. Đề tài tiến hành khảo sát khả năng tách chiết protease từ mẫu đầu và nội tạng tôm của dung môi: nước cất, nước muối sinh lý, đệm phosphate và Tris-HCl với các tỷ lệ khác nhau. Chọn ra dung môi với tỷ lệ chiết thích hợp thu DC; Khảo sát khả năng tủa của các tác nhân: cồn ethylic, acetone và muối sulfate amon với các nồng độ (tỷ lệ) khác nhau. Chọn tác nhân tủa với nồng độ (tỷ lệ) thích hợp tủa DC thu CPT; Khảo sát các tính chất tối ưu cho hoạt động protease CPT của mẫu nội tạng từ tác nhân tủa tốt nhất; Tinh sạch protease CPT của các tác nhân tủa với nồng độ thích hợp từ mẫu nội tạng và mẫu đầu tôm bằng sắc ký lọc gel áp suất thấp, Bio-Gel P 100. Xác định trọng lượng phân tử protease sau tinh sạch bằng kỹ thuật điện di SDS-PAGE. Kết quả thí nghiệm: dung môi tách chiết Tris-HCl với tỷ lệ mẫu/dd Tris-HCl =1/7 (w/v); Tác nhân tủa cồn với tỷ lệ DC/dd cồn = 1/6 (v/v); Protease CPT tủa cồn của mẫu nội tạng hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 47oC, pH 7,0, nồng độ muối ăn 3%. Kết quả điện di SDS-PAGE cho thấy enzyme sau tinh sạch có trọng lượng phân tử nằm trong khoảng từ 37.775 Da đến 69.257 Da.
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN IV
TÓM TẮT KHÓA LUẬN . V
DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT IX
DANH SÁCH CÁC BẢNG X
DANH SÁCH HÌNH VÀ ĐỒ THỊ XI
Chương 1. MỞ ĐẦU . 1
1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ 1
1.2. MỤC ĐÍCH VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI . 2
Chương 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ ENZYME . 3
2.1.1. Lược sử các công trình nghiên cứu enzyme 3
2.1.2. Định nghĩa về enzyme . 4
2.1.3. Cấu tạo phân tử . 4
2.1.4. Danh pháp quốc tế và phân loại . 6
2.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động enzyme 6
2.2. KHÁI QUÁT PROTEASE VÀ PROTEASE CỦA TÔM . 8
2.2.1. Giới thiệu về tôm . 8
2.2.2. Khái quát protease 10
2.2.2.1. Định nghĩa protease . 10
2.2.2.2. Protease của tôm 11
2.2.2.3. Tình hình nghiên cứu protease trong nước và ngoài nước 12
a). Nghiên cứu trong nước 12
b). Nghiên cứu ngoài nước 13
2.2.3. Ứng dụng của protease . 14
2.3. PHưƠNG PHÁP TÁCH VÀ LÀM SẠCH ENZYME TRONG NGHIÊN CỨU 15
2.3.1. Phương pháp trích ly enzyme. . 15
2.3.2. Phương pháp làm sạch enzyme . 16
2.3.3. Giới thiệu phương pháp sắc ký lọc gel . 18
2.3.3.1. Bản chất của phương pháp . 18
2.3.3.2. Chọn lựa và chuẩn bị gel 20
a). Chọn lựa gel . 20
b). Chuẩn bị gel và bảo quản . 20
2.3.3.3. Dựng cột và chuẩn bị mẫu . 20
a). Dựng cột lọc gel . 20
b). Chuẩn bị mẫu . 21
2.3.3.4. Một số ứng dụng của phương pháp lọc gel 21
vii
2.3.3.5. ưu và nhược điểm của sắc ký lọc gel 22
a). ưu điểm 22
b). Nhược điểm . 22
2.4. XÁC ĐỊNH TRỌNG LưỢNG PHÂN TỬ BẰNG ĐIỆN DI SDS-PAGE . 22
2.5. PHưƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG XÚC TÁC CỦA ENZYME . 24
2.5.1. Phương pháp Biuret 24
2.5.2. Phương pháp Lowry 25
2.5.3. Phương pháp Bradford . 25
2.5.4. Phương pháp BCA [Bicinchoninic Acid] (1985) 26
2.5.5. Phương pháp đo phổ . 26
Chương 3. VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27
3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM 27
3.2. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ DỤNG CỤ NGHIÊN CỨU . 27
3.2.1. Vật liệu 27
3.2.2. Hóa chất 28
3.2.3. Thiết bị 28
3.3. CÁC PHưƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐÃ ÁP DỤNG 29
3.4. PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29
3.4.1. Chiết rút thu dịch chiết protease nội tạng và đầu tôm sú . 29
3.4.2. Thu nhận chế phẩm protease 29
3.4.3. Bố trí thí nghiệm 30
3.4.3.1. Xác định dung môi và chế độ tách chiết protease từ nội tạng và đầu tôm sú thích hợp 31
3.4.3.2. Xác định tác nhân tủa thích hợp và nồng độ thu CPT từ DC 32
3.4.3.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính protease của CPT . 33
a). Nhiệt độ 33
b). pH . 33
c). Nồng độ muối ăn 34
3.4.4. Tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel . 35
3.4.5. Xác định trọng lượng phân tử bằng phương pháp điện di SDS-PAGE 35
3.4.6. Phương pháp xử lý số liệu . 35
Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 36
4.1. XÁC ĐỊNH DUNG MÔI VÀ TỶ LỆ CHIẾT TÁCH ENZYME . 36
4.1.1. Khả năng tách chiết protease của nước cất ở các tỷ lệ khác nhau . 36
4.1.2. Khả năng tách chiết protease của nước muối sinh lý ở các tỷ lệ khác nhau . 38
4.1.3. Khả năng tách chiết protease của đệm phosphate pH 7,0 ở các tỷ lệ khác nhau . 39
4.1.4. Khả năng tách chiết protease của đệm Tris-HCl pH 7,5 ở các tỷ lệ khác nhau . 41
4.1.5. Lựa chọn dung môi tách chiết protein-enzyme thích hợp . 42
4.2. XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN TỦA THU HỒI CHẾ PHẨM TỪ DC . 44
viii
4.2.1. Khả năng tủa protease của cồn ở các tỷ lệ khác nhau . 44
4.2.2. Khả năng tủa protease của acetone ở các nồng độ khác nhau . 46
4.2.3. Khả năng tủa protease của (NH4)2SO4 ở các nồng độ muối bão hòa khác nhau . 47
4.2.4. So sánh khả năng tủa thu CPT của các tác nhân . 49
4.3. KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HưỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH PROTEASE CỦA CPT . 51
4.3.1. Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme proease của CPT từ mẫu nội tạng tôm sú 51
4.3.2. Ảnh hưởng pH đến hoạt tính protease của CPT từ mẫu nội tạng tôm sú . 52
4.3.3. Ảnh hưởng nồng độ muối ăn đến hoạt tính protease của CPT từ mẫu nội tạng tôm sú 53
4.4. TINH SẠCH PROTEASE CPT BẰNG SẮC KÝ LỌC GEL 55
4.5. XÁC ĐỊNH TRỌNG LưỢNG PHÂN TỬ- ĐIỆN DI SDS – PAGE 59
Chương 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 64
5.1. KẾT LUẬN 64
5.2. ĐỀ NGHỊ 65
TÀI LIỆU THAM KHẢO 66
PHỤ LỤC . 1
Phụ lục chương 3 69
1. Phương pháp xác định hàm lượng protein theo Bradford 1
2. Xác định hoạt tính protease bằng phương pháp Amano 3
3. Phương pháp sắc ký lọc gel 7
4. Điện di SDS-PAGE . 9
a). Chuẩn bị hộp điện di 9
b). Chuẩn bị mẫu protein . 10
c). Đưa mẫu vào các giếng 10
Phụ lục chương 4 80