Thạc Sĩ Tách chiết, tinh sạch và cố định enzyme bromelin từ dứa

MỞ ĐẦU

1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong những năm gần đây người ta dành sự quan tâm rất nhiều đến việc tách chiết enzyme bromelain để sử dụng làm tác nhân kích thích tiêu hóa, chữa vết thương, ổn định dịch lên men. Việc nghiên cứu thành công một enzyme là ở việc chiết xuất, xác định đặt tính, yếu tố ảnh hưởng hoạt động của enzyme. Việc tinh chế enzyme hết sức cần thiết bởi làm cho enzyme tinh sạch ít còn lẫn tạp chất (các protein không phải enzyme), nâng cao hoạt tính enzyme so với dạng thô nhiều lần, thuận lợi cho nghiên cứu, bảo quản, nguyên liệu cho một số ngành công nghệ thực phẩm và trong dược phẩm dùng làm thuốc trong điều trị và sản xuất.

Bên cạnh đó việc nâng cao hiệu suất sử dụng enzyme bromelain cũng đang được nghiên cứu. Phương pháp cố định enzyme là một trong những hướng nghiên cứu nhằm nâng cao hiệu suất sử dụng enzyme. Bằng cách cố định enzyme trong chất mang không tan trong nước enzyme có thể tách ra khỏi cơ chất dễ dàng sau phản ứng. Thêm vào đó enzyme cố định được tái sử dụng nhiều lần khắc phục tình trạng khan hiếm enzyme như hiện nay.

Ngày nay, enzyme đã được sản xuất và sử dụng trong nhiều lĩnh vực như công nghệ thực phẩm, y học, dược phẩm và các ngành công nghiệp khác. Đối với nước ta nguồn enzyme từ thực vật có triển vọng lớn vì nguồn nguyên liệu rất phong phú (dứa, đu đủ, .). Trong quá trình chế biến dứa đóng hộp chỉ khoảng 30% quả dứa được sử dụng, còn lại 70% phụ phẩm mà chủ yếu là chồi trên quả dứa, thân dứa (Hội thảo quốc gia năm 2005). Nếu tận dụng được nguồn phế phẩm thì vừa có thể giảm thiểu chất thải hữu cơ gây ô nhiễm môi trường vừa có thể sản xuất sản phẩm bromelain bởi vì hầu như trên tất cả các bộ phận của cây dứa đều có enzyme. Bromelain có ba hoạt tính khác nhau: peptidase, amidase, esterase. Bromelain thân, chồi có thể phân hủy cả cơ chất tự nhiên lẫn cơ chất tổng hợp, chúng là enzyme có giá trị kinh tế và hầu hết sản phẩm bromelain Thương mại được ly trích từ thân dứa.

Trong đề tài này chúng tôi đã tiến hành tách chiết, tinh sạch enzyme bromelain ở quy mô nhỏ. Khảo sát các tác nhân tủa, xác định pH, nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt cho hoạt động của enzyme trên chồi dứa. Cố định enzyme bromelain trên Natrialginate bằng phương pháp tủa muối Ammonium sulfate.

1.2. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI

1.2.1. Mục tiêu tổng quát

Tách chiết và tinh sạch enzyme bromelain từ chồi dứa.
Cố định enzyme bromelain trên Natrialginate.

1.2.2. Mục tiêu cụ thể

Thu nhận dịch enzyme bromelain từ các bộ phận quả dứa: chồi dứa, mắt dứa, thân dứa, cùi dứa.
Xác định tỉ lệ cồn 96o, nồng độ muối Ammonium sulfate và tỉ lệ aceton tối ưu để tủa enzyme bromelain.
Xác định pH, nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt cho sự hoạt động của enzyme bromelain.
So sánh các tác nhân tủa của bộ phần chồi dứa sau khi tủa.
Cố định enzyme bromelain trên Natrialginate.
So sánh hàm lượng và hoạt tính enzyme bromelain cố định với hàm lượng và hoạt tính enzyme trước khi cố định.
Tinh sạch enzyme bromelain.
Xác định trọng lượng phân tử enzyme bromelain bằng phương pháp điện di.

1.3. MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU

Làm cơ sở nghiên cứu để sản xuất enzyme bromelain từ lượng phế phẩm lớn là chồi dứa. Đồng thời cố định enzyme bromelain trên cơ chất Natrialginate để mang lại hiệu quả kinh tế trong công nghiệp.

1.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1.4.1. Nghiên cứu lý thuyết

Thu thập tài liệu trong và ngoài nước có liên quan đến nội dung nghiên cứu.
Tổng hợp phân tích, so sánh và đánh giá lựa chọn hướng nghiên cứu phù hợp.
Phân tích đánh giá điều kiện thực tế về kỹ thuật, kinh tế, Xã hội để xác định giới hạn nghiên cứu và phương án thực nghiệm.

1.4.2. Nghiên cứu thực nghiệm

Lập kế hoạch thực hiện thí nghiệm.

Xử lý kết quả bằng Excel và phần mềm Statgraphics.

1.5. GIỚI HẠN ĐỀ TÀI

Vì lý do giới hạn về thời gian và kinh tế, đề tài chỉ thực hiện tủa enzyme với ba tác nhân tủa (muối, cồn và aceton), tinh sạch enzyme bromelain trên Biogel P-100, điện di bằng phương pháp SDS-PAGE và chỉ thực hiện cố định enzyme trên cơ chất Natrialginate ở quy mô phòng thí nghiệm.


CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU
1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ
1.2. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI
1.2.1. Mục tiêu tổng quát
1.2.1. Mục tiêu cụ thể
1.3. MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU
1.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1.4.1. Nghiên cứu lý thuyết
1.4.2. Nghiên cứu thực nghiệm
1.5. GIỚI HẠN CỦA ĐỀ TÀI

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

2.1. SƠ LƯỢC VỀ CÂY DỨA
2.1.1. Lịch sử và sự phát triển của cây dứa
2.1.2. Thành phần dinh dưỡng trong dứa
2.1.3. Các bộ phận trên cây dứa có thể cho enzyme bromelain
2.1.3.1. Quả
2.1.3.2. Thân
2.1.3.3. Lá
2.1.3.4. Rễ
2.2. GIỚI THIỆU SƠ LƯỢC VỀ ENZYME
2.3. ENZYME PROTEASE
2.3.1. Giới thiệu sơ lược các enzyme protease
2.3.1.1. Protease vi sinh vật
2.3.1.2. Protease động vật
2.3.1.3. Protease thực vật
2.3.2. Ứng dụng của enzyme protease
2.4. ENZYME BROMELAIN THU NHẬN TỪ DỨA
2.4.1. Giới thiệu enzyme bromelain
2.4.2. Tính chất vật lý của enzyme bromelain
2.4.3. Tính chất hoá học của enzyme bromelain
2.4.3.1. Cấu tạo hoá học
2.4.3.2. Cấu trúc không gian của bromelain
2.4.4. Hoạt tính của enzyme bromelain
2.4.4.1. Cơ chế tác động
2.4.4.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme bromelain
2.4.5. Ứng dụng của enzyme bromelain
2.4.5.1. Trong công nghiệp thực phẩm
2.4.5.2. Trong y dược học
2.4.5.3. Một số enzyme bromelain thương mại
2.4.6. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về enzyme bromelain
2.4.6.1. Nghiên cứu trong nước
2.4.6.2. Nghiên cứu ngoài nước
2.5. KĨ THUẬT CƠ BẢN CHUẨN BỊ DỊCH PROTEIN THÔ
2.6. CÁC PHƯƠNG PHÁP TỦA PROTEIN
2.6.1. Tủa bằng muối sulfate ở các nồng độ khác nhau
2.6.2. Tủa bằng dung môi hữu cơ
2.6.3. Tủa bằng điểm đẳng nhiệt
2.6.4. Tủa bằng các loại polymer
2.6.5. Tủa bằng các chất đa điện phân
2.7. SỰ CỐ ĐỊNH ENZYME
2.7.1. Định nghĩa enzyme cố định
2.7.2. Tính chất ưu và nhược của enzyme cố định
2.7.2.1. Ưu điểm
2.7.2.2. Nhược điểm
2.7.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme cố định
2.7.4. Các phương pháp cố định enzyme
2.7.4.1. Phương pháp liên kết enzyme với vật liệu cố định
2.7.4.2. Phương pháp hấp thụ vật lí
2.7.4.3. Phương pháp nhốt
2.7.4.4. Phương pháp khâu mạch
2.7.5. Đặc điểm, tính chất của Natrialginate
2.7.6. Ứng dụng của enzyme cố định
2.7.6.1. Trong công nghiệp
2.7.6.2. Trong y học
2.7.6.3. Trong nghiên cứu khoa học
2.7.6.4. Trong bảo vệ môi trường
2.7.7. Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước
2.7.7.1. Tình hình nghiên cứu trong nước
2.7.7.2. Tình hình nghiên cứu nước ngoài

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1. VẬT LIỆU
3.1.1. Chế phẩm enzyme thô
3.1.2. Hóa chất
3.1.3. Thiết bị
3.2. PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
3.2.1. Chiết thô enzyme từ chế phẩm dứa
3.2.2. Phương pháp xác định hàm lượng protein và hoạt tính bromelain từ dịch chiết enzyme thô
3.2.2.1. Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford
3.2.2.2. Xác định hoạt tính enzyme theo phương pháp Amano
3.2.3. Tách enzyme bằng các phương pháp tủa bằng cồn 960, muối Ammonium sulfate (NH4)2SO4 và aceton(CH3COCH3)
3.2.3.1. Nguyên tắc
3.2.3.2. Phương pháp thí nghiệm tủa enzyme bằng cồn 960
3.2.3.3. Phương pháp thí nghiệm tủa bằng muối Ammonium sulfate
3.2.3.4. Phương pháp thí nghiệm tủa bằng aceton
3.2.4. Phương pháp xác định tỉ lệ cồn 960, nồng độ muối (NH4¬)2SO4 và tỉ lệ aceton tối ưu để tủa enzyme bromelain
3.2.5. Phương pháp xác định pH, nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt cho hoạt động của enzyme bromelain.
3.2.5.1. Xác định pH tối ưu cho hoạt động của bromelain
3.2.5.2. Xác định nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của bromelain
3.2.5.3. Khảo sát độ bền nhiệt
3.2.6. Cố định enzyme bromelain trên cơ chất Natrialginate bằng phương pháp nhốt
3.2.6.1. Tạo dung dịch Natrialginate 3%
3.2.6.2. Tiến hành cố định
3.2.6.3. Phương pháp xác định hiệu suất cố định protein và hiệu suất cố định hoạt tính của enzyme cố định
3.2.7. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố lý hoá đến hoạt tính của enzyme bromelain được cố định trên Natrialginate.
3.2.7.1. Khảo sát ảnh hưởng của pH
3.2.7.2. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ
3.2.7.3. Khảo sát độ bền nhiệt
3.2.8. Khảo sát số lần tái sử dụng bromelain cố định trên Natrialginate
3.2.9. Bước đầu tinh sạch enzyme bromelain chồi dứa bằng sắc ký lọc gel
3.2.9.1. Nguyên tắc
3.2.9.2. Thiết bị và hóa chất
3.2.9.3. Các bước tiến hành
3.2.9.4. Tính hiệu suất về hoạt tính enzyme protease và độ tinh sạch của enzyme sau tinh sạch bằng sắc ký lọc gel
3.2.10. Xác định trọng lượng phân tử enzyme bromelain bằng phương pháp điện di SDS - PAGE
3.2.10.1. Nguyên tắc
3.2.10.2. Thiết bị và hóa chất
3.2.10.3. Phương pháp
3.2.10.4. Xác định trọng lượng phân tử của protein

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

4.1. HÀM LƯỢNG PROTEIN VÀ HOẠT TÍNH ENZYME BROMELAIN DỊCH CHIẾT THÔ CÁC BỘ PHẬN TRÊN QUẢ DỨA.
4.2. KHẢO SÁT TÁC NHÂN TỦA ENZYME BROMELAIN LÀ CỒN 960
4.2.1. Hàm lượng protein và hoạt tính bromelain bộ phận chồi trong dịch tủa là cồn 960
4.2.2. Xác định pH, nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt cho hoạt tính bromelain bộ phận chồi trong dịch tủa cồn với tỉ lệ 1 dứa : 4 cồn
4.2.2.1. pH tối ưu
4.2.2.2. Nhiệt độ tối ưu
4.2.2.3. Khảo sát độ bền nhiệt
4.3. KHẢO SÁT TÁC NHÂN TỦA ENZYME BROMELAIN LÀ MUỐI AMMONIUM SULFATE
4.3.1. Hàm lượng protein và hoạt tính bromelain bộ phận chồi trong dịch tủa là muối Ammonium sulfate ((NH4¬)2SO4)
4.3.2. Xác định pH, nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt cho hoạt tính bromelain bộ phận chồi trong dịch tủa muối với nồng độ 60%
4.3.2.1. pH tối ưu
4.3.2.2. Nhiệt độ tối ưu
4.3.2.3. Khảo sát độ bền nhiệt
4.4. KHẢO SÁT TÁC NHÂN TỦA ENZYME BROMELAIN LÀ ACETON (CH3COCH3)
4.4.1. Hàm lượng protein và hoạt tính bromelain bộ phận chồi trong dịch tủa là aceton (CH3COCH3)
4.4.2. Xác định pH, nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt cho hoạt tính bromelain bộ phận chồi trong dịch tủa aceton với tỉ lệ 1 dứa : 5 aceton
4.4.2.1. pH tối ưu
4.4.2.2. Nhiệt độ tối ưu
4.4.2.3. Khảo sát độ bền nhiệt
4.5. SO SÁNH VIỆC TỦA ENZYME BROMELAIN TRONG CỒN 960, MUỐI AMMONIUM SULFATE VÀ ACETON
4.6. CỐ ĐỊNH ENZYME BROMELAIN TRÊN NATRIALGINATE
4.6.1. Kết quả quá trình cố định enzyme bromelain trên chất mang Natrialginate
4.6.2. Hiệu suất cố định protein và hiệu suất cố định hoạt tính của enzyme bromelain trên gel Natrialginate
4.6.3. So sánh hàm lượng và hoạt tính enzyme bromelain cố định với hàm lượng và hoạt tính enzyme trước khi cố định
4.6.4. Khảo sát hoạt tính của enzyme cố định trên Natrialginate theo pH, nhiệt độ và độ bền nhiệt
4.6.4.1. Khảo sát hoạt tính của enzyme cố định theo pH
4.6.4.2. Khảo sát hoạt tính của enzyme cố định theo nhiệt độ
4.6.4.3. Khảo sát hoạt tính của enzyme cố định theo độ bền nhiệt
4.6.5. Khảo sát số lần tái sử dụng bromelain cố định trên Natrialginate
4.6.6. So sánh độ bền nhiệt của chế phẩm enzyme ban đầu trước khi cố định và enzyme cố định trên Natrialginate
4.7. TINH SẠCH ENZYME BROMELAIN TRÊN BIOGEL P-100
4.7.1. Hàm lượng protein và hoạt tính bromelain trước khi tinh sạch
4.7.2. Tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel với các thông số
4.7.3. Tinh sạch enzyme đã tủa với cồn 960
4.7.4. Tinh sạch enzyme đã tủa với muối Ammonium sulfate
4.7.5. Tinh sạch enzyme đã tủa với aceton
4.7.6. So sánh kết quả giữa chế phẩm enzyme thô và dịch enzyme sau khi đã qua quá trình sắc ký lọc gel
4.8. KẾT QUẢ PHÂN TÁCH HỆ ENZYME BROMELAIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI SDS - PAGE
4.8.1. Thành phần mẫu điện di
4.8.2. Kết quả điện di

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

5.1. KẾT LUẬN
5.2. KIẾN NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC