Tiến Sĩ Tách chiết, phân tích aflatoxin trong thực phẩm và dược liệu bằng cột sắc ký ái lực miễn dịch kết hợ

Luận án tiến sĩ năm 2011
Đề tài: Tách chiết, phân tích aflatoxin trong thực phẩm và dược liệu bằng cột sắc ký ái lực miễn dịch kết hợp sắc ký lỏng hiệu năng cao


MỤC LỤC
Trang
Lời cam đoan . i
Lời cảm ơn ii
Mục lục . iii
Danh mục các chữviết tắt . viii
Danh mục hình . x
Danh mục bảng xiv
ĐẶT VẤN ĐỀ . 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUANTÀI LIỆU 4
1.1. TỔNG QUAN VỀAFLATOXIN 4
1.1.1. Phát hiện aflatoxin 4
1.1.2. Aspergillus flavusvà aflatoxin . 4
1.1.3. Tính chất hóa, lý của aflatoxin 5
1.1.4. Độc tính của aflatoxin 8
1.1.5. Giới hạn của aflatoxin trong thực phẩm 10
1.1.6. Giới hạn aflatoxin trong dược liệu 12
1.2. PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG AFLATOXIN . 12
1.2.1.Lấy mẫu . 12
1.2.2. Chuẩn bịmẫu 12
1.2.3. Phân tích mẫu 16
- iv -1.3. NHỮNG NGHIÊN CỨU CHẾTẠO CỘT SẮC KÝ ÁI LỰC MIỄN DỊCH
CHO AFLATOXIN 23
1.3.1. Kháng thể . 23
1.3.2. Cộng hợp kháng nguyên aflatoxin –BSA 24
1.3.3. Tạo kháng thểkháng aflatoxin . 26
1.3.4. Tinh chếkháng thể 30
1.3.5. Cốđịnh kháng thểvào pha rắn . 31
1.3.6. Các đặc tính chiết xuất pha rắn của chất hấp thụái lực miễn dịch 34
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP . 38
2.1. VẬT LIỆU 38
2.1.1. Thiết bị . 38
2.1.2. Hóa chất . 38
2.2. PHƯƠNG PHÁP 40
2.2.1. Phương pháp gây miễn dịch tạo kháng thểkháng aflatoxin . 40
2.2.2. Phương pháp khuếch tán kép trên thạch . 41
2.2.3. Phương pháp tinh chếkháng thểdùng muối amoni sulfat 42
2.2.4. Phương pháp thẩm tích (đưa protein ởdạng tủa trởlại dạng dung dịch)42
2.2.5. Phương pháp điện di trên gel polyacrylamid có natri dodecyl sulfat . 43
2.2.6. Xác định nồng độprotein bằng phương pháp Bradford . 45
2.2.7. Cộng hợp protein vào gel sepharose CL-4B hoạt hóa với CNBr . 45
- v -2.2.8. Phương pháp nén cột . 45
2.2.10. Pha dung dịch aflatoxin chuẩn . 46
2.2.11. Phương pháp chiết aflatoxin từmẫu cần phân tích bằng cột IAC 47
2.2.12. Phương pháp chiết aflatoxin từmẫu cần phân tích bằng cột SPE C18. 47
2.2.13. Phương pháp làm giảmẫu nhiễm aflatoxin . 48
2.2.14. Phương pháp tạo dẫn xuấtcác aflatoxin 48
2.2.15. Phương pháp sắc ký lỏng pha đảo phân tích aflatoxin 48
2.2.16. Phương pháp khảo sát các thông sốkỹthuật của cột sắc ký ái lực bắt
aflatoxin . 48
2.2.16.1. Độlặp lại của các cột . 48
2.2.16.2. Dung lượng cột 49
2.2.16.3. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng . 49
2.2.16.4. Xác định độtuyến tính . 50
2.2.16.5. Xác định hiệu suất thu hồi . 50
2.2.16.6. Theo dõi độ ổn định của cột . 51
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ 52
3.1. CHẾTẠO CỘT SẮC KÍ ÁI LỰC CHO AFLATOXIN . 52
3.1.1. Sản xuấtkháng thểkháng aflatoxin . 52
3.1.1.1. Gây miễn dịch trên thỏ . 53
3.1.2. Chếtạo cột sắc ký ái lực bắt aflatoxin 58
3.1.2. Chếtạo cột sắc ký ái lực bắt aflatoxin 59
3.1.1.2. Kiểm tra đáp ứng miễn dịch 54
2.2.9. Phương pháp sắc ký ái lực miễn dịch 46
- vi -3.1.2.1. Chọn nồng độkháng thểliên kết với gel ái lực . 59
3.1.2.2. Khảo sát các thông sốkỹthuật của cột IAC Pasteur . 63
3.2. ĐÁNH GIÁ KHẢNĂNG ỨNG DỤNG CỘT IAC-PASTEURCHO PHÂN
TÍCH AFLATOXIN TRONG THỰC PHẨM VÀ DƯỢC LIỆU . 68
3.2.1. Khảo sát trên mẫu thực phẩm 68
3.2.1.1. Khảo sát trên mẫu ngô . 68
3.2.1.2. Khảo sát trên mẫu lạc 76
3.2.2. Khảo sáttrên mẫu dược liệu . 81
3.2.2.1. Khảo sát trên mẫu cam thảo 81
3.2.2.2. Khảo sát trên mẫu gừng . 87
3.3. SO SÁNH CÁC PHƯƠNG PHÁP XỬLÝ MẪU KHÁC 92
3.3.1. So sánh với phương pháp xửlý m ẫu bằng cột SPE C18 . 92
3.3.1.1. Trên nền mẫu thực phẩm 92
3.3.1.2. Trên nền mẫu dược liệu . 96
3.3.2. So sánh với phương pháp xửlý m ẫu bằng cột sắc ký ái lực của hãng
Vicam . 99
3.3.2.1. So sánh trên mẫu cộng chuẩn . 99
3.3.2.2. So sánh trên mẫu thực . 103
3.4. ÁP DỤNG CỘT IAC-PASTEUR LÀM SẠCH MẪU ĐỊNH LƯỢNG
AFLATOXIN TRÊN MỘT SỐNỀN MẪU THỰC PHẨM VÀ DƯỢC LIỆU 105
3.4.1. Trên một sốnền mẫu thực phẩm 105
- vii -3.4.2. Trên một sốnền mẫu dược liệu 106
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 107
4.1. BÀN LUẬN VỀCHẾTẠO CỘT SẮC KÝ ÁI LỰC CHO AFLATOXIN 107
4.1.1. Vềsản xuấtkháng thể kháng aflatoxin 107
4.1.1.1. Vềgây miễn dịch trên thỏ .107
4.1.1.2. Vềkiểm tra đáp ứng miễn dịch 109
4.1.2. Vềchếtạo cột sắc ký ái lực bắt aflatoxin 111
4.1.2.1. Vềchọn nồng độkháng thểliên kết vào gel ái lực 111
4.1.2.2. Vềkhảo sát các thông sốkỹthuật của cột IAC Pasteur 112
4.2. BÀN LUẬN VỀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CỘT IAC-PASTEUR CHO
PHÂN TÍCH AFLATOXIN TRONG THỰC PHẨM VÀ DƯỢC LIỆU . 114
4.3. BÀN LUẬN VỀSO SÁNH CÁC PHƯƠNG PHÁP XỬLÝ MẪU KHÁC 118
4.3.1. Với phương pháp xửlý mẫu bằng cột SPE C18 118
4.3.2. Với phương pháp xửlý mẫu bằng cột IACcủa hãng Vicam . 121
4.4. BÀN LUẬN VỀ ÁP DỤNG CỘT IAC-PASTEUR ĐỂ XÁC ĐỊNH
AFLATOXIN TRONG MỘT SỐTHỰC PHẨM VÀ DƯỢC LIỆU . 122
KẾT LUẬN VÀ ĐỀXUẤT 125
DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ 127
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


ĐẶT VẤN ĐỀ
Aflatoxin thuộc nhóm cácchất chuyển hóa có độc tính cao, được tiết ra từ các vi
nấm Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus. Điều kiện thời tiết nóng, ẩm, mưa
nhiều ở Việt Nam rất thích hợp cho các loại vi nấm này phát triển mạnh và sản xuất ra
aflatoxin.Aflatoxin thường nhiễm trên cácloại thực phẩm thiết yếu cho người và vật
nuôi như gạo, ngô, lạc, đậu, cám
Người bị nhiễm aflatoxin do ăn phải các loại ngũ cốc có aflatoxin hoặc ăn các sản
phẩm như thịt, cá, trứng, sữa lấytừ động vật được nuôi bằng thức ăn nhiễm aflatoxin.
Dùng các chất chỉthịsinh học theo dõi trong suốt 10-15 năm, ngườita nhận thấy rằng
ngay từlúc còn là bào thai, con ngườiđãtiếp xúc với aflatoxin và sẽtiếp xúc liên tục
trong suốt cuộc đời sau này [79]. Nhiễm độc aflatoxin gây ra một loạt các triệu chứng
cấp tính và mạn tính. Nhiễm độc cấp có thểgây chết người. Nhiễm độc mạn thường
biểu hiện bằng ăn kém ngon, chậm lớn, tổn thương gan.Nhiễm độcmạn tính tác động
đếnyếu tốdi truyền tương ứng với3 kiểu gây ung thư, quái thai và đột biến [26][93].
Ảnh hưởngquan trọng nhất dẫn đến việc phải kiểm soát gắt gao hàm lượng aflatoxin
trong thựcphẩm là khả năng gây ung thư tế bào gan nguyên phát. Tổ chức nghiên cứu
ung thư quốc tế (IARC) đã xếp aflatoxin vào nhóm I: các chất gây ung thư cho người
[56].
Do độc tính của aflatoxin,đã có ít nhất 99 quốc gia trên thếgiới (trong đó có Việt
Nam) đưara các tiêu chuẩn vềgiới hạn của aflatoxin trong thực phẩm [28] đồng thời
quy định, hướng dẫn phương pháp phân tích xác định chúng.
Tất cả các kỹ thuật dùng định lượng aflatoxin, trừ kỹ thuật miễn dịch men
(ELISA), đều cần phải có giai đoạn làm sạch mẫu. Đểtránh bất lợi của phương pháp
chiết xuất lỏng-lỏng, xu thếhiện nay là thay thếnó bằng phương pháp chiết xuất pha
rắn (SPE). Các pha rắn khác nhau đã được sửdụng cho mục đích này như: Florisil,
- 2 -
silicagel-C18
và gần đây nhất là cột Mycosep đa chức năng. Chiết xuất pha rắn có ưu
điểm hơn chiết xuất lỏng-lỏng là dễthao tác hơn và cho kết quả có độlặp lại cũng như
độthu hồi tốt hơn. Bất lợi chủyếu của phương pháp này là độchọn lọc thấp. Gần đây,
cột sắc ký ái lực miễn dịch dựa trên kháng thể(Immuno affinity column-IAC)đã được
phát triển đểthay thếcho các phương pháp làm sạch pha rắn cổđiển. Ngoài các ưu
điểm như dễthao tác, độthu hồi và độlặp lại cao, cột IAC có ưu điểm vượt trội so với
cột SPE là có độchọn lọc cao, giúp phân tách dễdàng aflatoxin trên các nền mẫu phức
tạp từmẫu thức ăn, mẫu sinh học đếnmẫu mô động vật. Phương pháp làm sạch này
ngày càng được sửdụng nhiều trong phân tích aflatoxin và là phương pháp bắt buộc sử
dụng đối với các sản phẩm xuất khẩu. Sau giai đoạn làm sạch mẫu, người ta phát hiện
aflatoxin dựa trên đặc tính phát huỳnh quangcủa nó. AFB1
và AFG1
cần biến đổi thành
dẫn xuất AFB2a
và AFG2a
có khảnăng phát huỳnh quang mạnh hơn. Phương pháp tạo
dẫn xuất đơn giản nhất là sử dụng acid trifluoroacetic (TFA) để xúc tác phản ứng
[123]. Phương pháp HPLC với đầu dò huỳnh quang là phương pháp phát hiện
aflatoxin chính xác và hiệu quả.
Song song với việc cải thiện và nâng cao chất lượng cuộc sống của người dân
Việt Nam, nhu cầu đảm bảo chất lượng an toàn vệsinh thực phẩm ngày càng cao. Số
lượng và chủng loại mẫu được yêu cầu kiểm tra aflatoxin ngày càng nhiều và đa dạng.
Qui trình kiểm tra aflatoxin sẽđơn giản và chính xác hơn khi sửdụng cột IAC đểlàm
sạch mẫu. Hiện nay, cột IAC cho aflatoxin dùng tại Việt Nam đều được nhập từnước
ngoài với giá thành khá cao. Đây chính là nguyên nhân làm h ạnchếviệc thay thếcột
SPE bằng cột IAC trong qui trình kiểm tra aflatoxin tại các phòng xét nghiệm trong
nước. Do đó, có được qui trình sản xuất cột IAC cho aflatoxin trong nước với giá thành
phù hợp là rất cần thiết. Xuất phát từcơ sởkhoa học và yêu cầu thực tiễn vềphân tích
aflatoxin nêu ởtrên, tôi tiến hành nghiên cứu đềtài luận án:
“Tách chiết, phân tích aflatoxin trong thực phẩm và dược liệu bằng cột sắc ký
ái lực miễn dịch kết hợpsắc ký lỏng hiệu năng cao”.
- 3 -Mục tiêu của luận án là:
- Nghiên cứu chếtạo cột sắc ký ái lực cho aflatoxin
- Đánh giá khảnăng phân tích aflatoxin trên mẫu thực phẩm và dược liệu bằng
phương pháp làm sạch mẫu với cột sắc ký ái lực miễn dịch và định lượng aflatoxin
bằng sắc ký lỏng cao áp với đầu dò huỳnh quang.
Đềtài bao gồm các nội dung sau:
1. Chếtạo cột sắc ký ái lực miễn dịch cho aflatoxin.
2. Đánh giá khảnăng ứng dụng cột sắc ký ái lực cho phân tích aflatoxin trong
thực phẩm và dược liệu.
3. So sánh việc xửlý mẫu bằng cột sắc ký ái lực tựchếtạo với một sốphương
pháp xửlý mẫu khác.
4. Áp dụng cột sắc ký ái lực đểxác định aflatoxin trong một sốthực phẩm và
dược liệu.


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀAFLATOXIN:
1.1.1 Phát hiện aflatoxin:
Aflatoxinthuộc nhóm các độc tốcó nguồn gốc từvi nấm. Aflatoxinđược phát
hiện lần đầu vào khoảng 50 năm trước, khi đi tìm nguyên nhân gây dịch bệnh và gây
chết cho gà tây[12] cũng như gây ung thư cho cá[99].Sau đó, nguyên nhân được xác
định là do chúng ăn thức ăn có chứa lạc và hạt bông bị nhiễm nấm Aspergillus flavus.
Phân tích thức ăn, người ta tìm ra tác nhân gây chết là một sốchất chuyển hóa thứcấp
có độc tính của nấm. Các chất này được gọi là Aflatoxin(Aspergillus flavus toxin).
Aflatoxinđược sinh ra từmột nhóm sinh vật có quan hệ gần gũi của loài aspergilli: A.
flavus, A. parasiticusvà A. nomius. Gần đây, A. ochraceoroseusvà A. tamarii đã được
thêm vào danh sách này [39].
1.1.2. Aspergillus flavusvàaflatoxin :
A. flavuslà loài vi nấm chủyếu sản xuất ra aflatoxin(Hình1.1), được phân bố
rộng khắp thếgiới, đặc biệt là các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, có khảnăng gây
nhiễm trên nhiều loại thực phẩm khác nhau. Các vùng địa lý nằm giữa vĩtuyến 40
Bắc và 40Namcủa đường xích đạo có điều kiện thuận lợi đểnấm Aspergillus flavus
sản xuất aflatoxin.
Hình 1.1:Bào tử trần và bộ máy mang bào tử trần của loài Aspergillus flavus [59]


TÀI LIỆU THAM KHẢO
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
[1] Bộnông nghiệp và phát triển nông thôn (2001), Quy định vềđộc tốAflatoxin B1
và Aflatoxin tổng sốcủa Việt Nam, Số104/2001/QĐ/BNN.
[2] BộY tế(2008), Quy định giới hạn tối đa ô nhiễm sinh học và hóa học trong
thực phẩm, Nhà xuất bản Hà Nội.
[3] Bùi Xuân Đồng, Nguyễn Huy Văn (2000), Vi nấm dùng trong công nghệsinh
học, Nhà xuất bản khoa học và kỹthuật.
[4] Trần Trịnh Công (2008), Phân lập và nghiên cứu khảnăng sinh độc tốcủa một
số nấm mốc trên một số v ị thuốc đông dược của Việt Nam, Báo cáo kết quả
nghiên cứu đềtài cấp BộY tế.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
[5] AFRO (2006), Food Safety Newsletter World Health Organization.
[6] Ali N (2005), “Evaluation of a method to determine the natural occurrence of
aflatoxins in commercial traditional herbal medicines from Malaysia and
Indonesia”, Food and Chemical Toxicology, 43, pp. 1763 -1772.
[7] Alimentarius C. (1993), “Joint FAO/WHO Food standards Programme”, Food
Agriculture Organization, Rome, Italy, 3, pp. 59.
[8] Amersham Pharmacia Biotech (2001), “Affinity chromatography: principles and
methods”, The company.
[9] AOAC (1988), AOAC Official Method, 968.22.
[10] Aziz N.H., Yussef Y.A., El-Fouly M.Z., Moussa L.A. (1998), “Contamination
of some common medicinal plant samples and spices by fungi and their
mycotoxins”, Botanical Bulletin of Academia Sinica, 39, pp. 279 -285.
[11] Bagnati R., Paleologo-Oriundi M., Ubaldi A., Fanelli R. (1990), “Analysis of
diethylstilbestrol, dienestrol and hexestrol in biological samples by
immunoaffinity extraction and gas chromatography -negative-ion chemical
ionization mass spectrometry”, J. Chromatogr, 527, pp. 267-278.
[12] Blount WP. (1961), “Turkey "X" disease”, J Br Turk Fed 9, pp.52-54.
[13] Buchi G., Foulkes D.M., Kurono M., Mitchell G.F. (1966), “The total synthesis
of racemic aflatoxin B1”, J. Am. Chem. Soc, pp.88.
[14] Bullock E., Robert J.C, and Underwood J. G. (1962), “Studies in mycological
chemistry. Part Xl. The structure of isosterigmatocystin and an amended
structure for sterigmatocystin”, J. Chem. Soc, pp.4179-4183.
[15] Carisano A., Della Torre G. (1986), “Sensitive reversed-phase highperformance liquid chromatographic determination of aflatoxin M1 in dry
milk”, J. Chromatogr, 335, pp. 340.
[16] Carlos A. F., Oliveira NBG, Roice E. Rosim, and Andrezza M. Fernandes
(2009), “Determination of Aflatoxins in Peanut Products in the Northeast
Region of São Paulo, Brazil”, Int J Mol Sci, 10, pp. 174 -183.
[17] Cepeda A., Fente C. A., Vázquez B. I., Rodríguez J. L., Prognon P. and
Mahuzier G. (1996), “Postcolumn excitation of aflatoxins using cyclodextrins in
liquid chromatography for food analysis”, J. Chromatogr. A, 721, pp. 69-74.
[18] ChangH.L., De Vries J.W.(1983), “Rapid high pressure liquid chromatographic
determination of aflatoxin M1 in milk and nonfat dry milk”, J. Assoc. Off. Anal.
Chem, 66, pp. 913-917.
[19] Chu F.S., Ueno I. (1977), “Production of antibody against aflatoxin B
1
”, Appl
Environ Microbiol, 33, pp. 1125-1128.
[20] Clarke W., Jackson A., Reynolds B., Karle E.M., Hage D.S. (2000), “Antibody
immobilization to high-performance liquid chromatography supports:
Characterization of maximum loading capacity for intact immunoglobulin G and
Fab fragments”, J. Chromatogr. A, 888.
[21] Cohen H., Lapointe M. (1981), “HPLC determination and fluorescence
detection of aflatoxins in corn and dairy feeds”, J. Assoc. Off Anal. Chem, 64,
pp. 1372-1376.