Thạc Sĩ Sự phát triển chồi in vitro ở cây dứa Ananas comosus Merr dưới tác dụng của auxin, cytokinin và sự t

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Thành phố HỒ CHÍ MINH, năm 2009

MỤC LỤC

MỤC LỤC . i
CÁC CHỮ VIẾT TẮT . v
DANH MỤC ẢNH vi
DANH MỤC BẢNG ix
DANH MỤC HÌNH xxii
LỜI MỞ ĐẦU . 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. GIỚI THIỆU VỀ CÂY ANANNAS COMOSUS MERR 2
1.1.1.Vị trí phân loại 2
1.1.2. Đặc điểm sinh học . 2
1.1.2.1. Rễ . 2
1.1.2.2. Thân 3
1.1.2.3. Lá 3
1.1.2 4. Chồi 4
1.1.2.5. Hoa . 5
1.1.2.6. Quả . 5
1.1.2.7. Hạt 6
1.1.3. Các giống trồng . 6
1.1.3.1. Nhóm Caynen . 7
1.1.3.2. Nhóm Queen 7
1.1.3.3. Nhóm Red Spanish . 7
1.1.3.4. Nhóm Abacaxi 7
1.1.4. Giá trị dinh dưỡng và công dụng . 8
1.1.4.1. Giá trị dinh dưỡng . 8

1.1.4.2. Công dụng 9
1.2. Sự phát triển chồi . 10
1.2.1. Sự phát triển 10
1.2.2. Mô phân sinh ngọn 10
1.2.2.1. Cấu trúc mô phân sinh ngọn . 10
1.2.2.2. Yếu tố điều khiển kích thước của mô phân sinh ngọn . 12
1.2.3. Sự phát triển chồi 13
1.3. Vai trò của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật . 18
1.3.1.Auxin 18
1.3.2. Cytokinin . 20
1.3.3. Sự kết hợp giữa auxin và cytokinin . 21
1.3.4 Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật khác . 23
1.4. Ảnh hưởng của nitrogen trong quá trình phát triển chồi 23

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1. VẬT LIỆU 27
2.1.1. Vật liệu nuôi cấy in vitro .27
2.1.2. Vật liệu sinh trắc nghiệm 28
2.2. PHƯƠNG PHÁP . 28
2.2.1. Quan sát hình thái giải phẫu 28
2.2.2. Thí nghiệm sơ khởi 28
2.2.3. Xử lý chất điều hòa tăng trưởng thực vật 34
2.2.3.1. Xử lý riêng rẽ . 34
2.2.3.2. Xử lý phối hợp 34
2.2.3.3.Xử lí phối hợp các chất điều hòa tăng trưởng thực vật theo thời gian 36
2.2.4. Tạo cụm chồi . 37
2.2.5. Xử lý nitrogen 37

2.2.6. Tạo rễ 38
2.2.7. Khảo sát sự tăng trưởng của cây con trong vườn ươm 38
2.2.8. Phân tích thống kê . 38

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. KẾT QUẢ . 39
3.1.1. Quan sát hình thái giải phẫu 39
3.1.2. Thí nghiệm sơ khởi 39
3.1.2.1. Kích thước vùng mô phân ngọn ở ba vị trí non, trung gian và già . 39
3.1.2.2. Sự tăng trưởng của sơ khởi chồi có nguồn gốc từ chồi trên trái theo vị trí mẫu cấy 42
3.1.2.3. Hàm lượng đường tổng số và tinh bột 43
3.1.2.4. Cường độ hô hấp 44
3.1.2.5. Hoạt tính các chất điều hoà tăng trưởng thực vật 44
3.1.3. Xử lý các chất điều hòa tăng trưởng thực vật . 46
3.1.3.1. Xử lý riêng rẽ . 46
3.1.3.2. Xử lý phối hợp 53
3.1.3.3. Xử lí phối hợp các chất điều hoà tăng trưởng thực vật theo thời gian . 61
3.1.4 Tạo cụm chồi 62
3.1.5. Xử lý nitrogen 65
3.1.5.1. Thay đổi hàm lượng nitrogen tổng cộng 65
3.1.5.2. Thay đổi tỉ lệ NH4/NO3 . 68
3.1.6. Tạo rễ 69
3.1.7. Khảo sát sự tăng trưởng của cây con trong vườn ươm 71
3.2. THẢO LUẬN . 74

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

4.1. KẾT LUẬN . 80







DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Hàm lượng chất dinh dưỡng trong cây dứa Ananas comosus Merr . 9
Bảng 1.2. Nguồn gốc khác nhau của chồi bất định ở một số loài. 14
BẢng 3.1. Kích thước vùng mô phân sinh sơ khởi chồi ở ba vị trí non, trung gian và già của chồi trên trái dứa Ananas comosus Merr 39
Bảng 3.2. Chiều cao của sơ khởi chồi từ sự nuôi cấy khúc cắt sơ khởi chồi ở 3 vị trí non, trung gian, già trên môi trường MS và môi trường MS có bổ sung BA 0,5 mg/l và ANA 0,5 mg/l theo thời gian . 42
Bảng 3.3. Hàm lượng đường tổng số của khúc cắt sơ khởi chồi ở ba vị trí non, trung gian, già có nguồn gốc từ chồi trên trái dứa Ananas comosus Merr . 43
Bảng 3.4. Hàm lượng tinh bột của khúc cắt sơ khởi chồi ở ba vị trí non, trung gian, già có nguồn gốc từ chồi trên trái dứa Ananas comosus Merr 43
Bảng 3.5. Cường độ hô hấp của khúc cắt sơ khởi chồi ở ba vị trí non, trung gian, già có nguồn gốc từ chồi trên trái dứa Ananas comosus Merr . 44
Bảng 3.6. Hoạt tính các chất điều hoà tăng trưởng thực vật của khúc cắt sơ khởi chồi có nguồn gốc từ chồi trên trái dứa tương ứng với ba vị trí non, trung gian, già
45
Bảng 3.7. Kích thước vùng mô phân sinh ngọn từ sự nuôi cấy khúc cắt sơ khởi chồi ở vị trí trung gian sau 10 ngày trên môi trường MS có bổ sung AIA ở các nồng độ khác nhau . 46
Bảng 3.8. Kích thước vùng mô phân sinh ngọn từ sự nuôi cấy khúc cắt sơ khởi chồi ở vị trí trung gian sau 10 ngày trên môi trường MS có bổ sung ANA ở các nồng độ khác nhau . 47

Bảng 3.9. Kích thước vùng mô phân sinh ngọn từ sự nuôi cấy khúc cắt sơ khởi chồi ở vị trí trung gian sau 10 ngày trên môi trường MS có bổ sung BA ở các nồng độ khác nhau . 48
Bảng 3.10. Kích thước vùng mô phân sinh ngọn từ sự nuôi cấy khúc cắt sơ khởi chồi ở vị trí trung gian sau 10 ngày trên môi trường MS có bổ sung GA3 ở các nồng độ khác nhau . 49
Bảng 3.11. Kích thước vùng mô phân sinh ngọn từ sự nuôi cấy khúc cắt sơ khởi chồi ở vị trí trung gian sau 10 ngày trên môi trường MS có bổ sung BA, ANA ở các nồng độ khác nhau 53
Bảng 3.12. Kích thước vùng mô phân sinh ngọn từ sự nuôi cấy khúc cắt sơ khởi chồi ở vị trí trung gian sau 10 ngày trên môi trường MS có bổ sung BA, AIA ở các nồng độ khác nhau 55
Bảng 3.13. Kích thước vùng mô phân sinh ngọn từ sự nuôi cấy khúc cắt sơ khởi chồi ở vị trí trung gian sau 10 ngày trên môi trường MS có bổ sung BA, ANA và GA3 riêng rẽ hay phối hợp ở các nồng độ khác nhau 56
Bảng 3.14. Kích thước vùng mô phân sinh ngọn từ sự nuôi cấy khúc cắt sơ khởi chồi ở vị trí trung gian sau 10 ngày trên môi trường MS bổ sung BA, AIA và GA3 riêng rẽ hay phối hợp ở các nồng độ khác nhau. 57
Bảng 3.15. Kích thước vùng mô phân sinh ngọn từ sự nuôi cấy khúc cắt sơ khởi chồi ở vị trí trung gian trên môi trường MS bổ sung BA, ANA hay AIA ở các nồng độ khác nhau, theo thời gian . 58
Bảng 3.16. Số lá non màu xanh từ sự nuôi cấy khúc cắt sơ khởi chồi ở vị trí trung gian trên môi trường MS có bổ sung BA, AIA, GA3 phối hợp theo thời gian sau 5 tuần 61

Bảng 3.17. Số sơ khởi chồi hình thành từ khúc cắt thân Ananas comosus Merr sau 2 tuần nuôi cấy ở môi trường MS bổ sung chất điều hòa tăng trưởng thực vật khác nhau 62
Bảng 3.18. Kích thước vùng mô phân sinh ngọn từ sự nuôi cấy khúc cắt sơ khởi chồi ở vị trí trung gian trên môi trường MS có bổ sung BA 1mg/l và AIA 0,1 mg/l với hàm lượng N thay đổi sau 10 ngày . 65
Bảng 3.19. Số lượng chồi, chiều cao chồi, số lá và chiều dài lá từ sự nuôi cấy chồi 4 tuần tuổi trên môi trường MS bổ sung BA 1mg/l và AIA 0,1 mg/l với hàm lượng N thay đổi . 67
Bảng 3.20. Số lượng chồi, chiều cao chồi, số lá và chiều dài lá từ sự nuôi cấy chồi 4 tuần tuổi trên môi trường MS bổ sung BA 1mg/l và AIA 0,1 mg/l với với tỉ lệ NH4/ NO3 thay đổi sau 5 tuần 68
Bảng 3.21. Số sơ khởi rễ tạo thành từ cây con 6 tuần tuổi của cây dứa Ananas
comosus Merr sau 1 tuần nuôi cấy trong môi trường MS có bổ sung các chất điều hòa tăng trưởng khác nhau . 69
B?ng 3.22. Chiều cao cây, số lá, sổ rễ và chiều dài rễ c?a cây con invitro sau 20 ngày chuyển ra vườn ươm 71



DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Sơ đồ các loại lá dứa Ananas comosus Merr 4
Hình 1.2. Sơ đồ các dạng chồi dứa Ananas comosus Merr . 5
Hình 1.3. Cấu trúc mô phân sinh ngọn . 12
Hình 1.4. Các giai đoạn phát triển chồi ở cây Saintpaula ionantha . 15
Hình 1.5. Các giai đoạn phát triển chồi bất định ở Lilium longgiflorum 16
Hình 2.1. Sơ đồ chỉ ba vị trí non, trung gian, già của sơ khởi chồi có nguồn gốc từ chồi trên trái dứa Ananas comosus err. 29
Hình 2.2. Chiều ngang và chiều cao của mô phân sinh ngọn . 29
Hình 2.3. Sơ đồ ly trích các chất điều hòa tăng trưởng thực vật 33
Hình 2.4. Sơ đồ xử lí phối hợp các chất điều hòa tăng trưởng thực vật theo thời gian.
36
Hình 3.1. Hoạt tính các chất điều hoà tăng trưởng thực vật của khúc cắt sơ khởi chồi có nguồn gốc từ chồi trên trái dứa tương ứng với ba vị trí non, trung gian, già . 45



DANH MỤC ẢNH

Ảnh 1.1. Cây dứa Ananas comosus Merr 2
Ảnh 1.2 : Sự phát triển chồi từ lá cây dứa Ananas comosus Merr trong môi trường
MS bổ sung ANA 1 mg/l và BA 2 mg/l 17
Ảnh 2.1. Chóp lá trên trái dứa Ananas comosus Merr 27
Ảnh 3.1. Mô phân sinh ngọn của sơ khởi chồi ở vị trí non có nguồn gốc từ chồi trên trái dứa Ananas comosus Merr 40
Ảnh 3.2. Mô phân sinh ngọn của sơ khởi chồi ở vị trí trung gian có nguồn gốc từ chồi trên trái dứa Ananas comosus Merr . 40
Ảnh 3.3. Mô phân sinh ngọn của sơ khởi chồi ở vị trí già có nguồn gốc từ chồi trên trái dứa Ananas comosus Merr 41
Ảnh 3.4. Mô phân sinh ngọn từ sự nuôi cấy khúc cắt sơ khởi chồi ở vị trí trung gian sau 10 ngày trên môi trường MS (đối chứng) 50
Ảnh 3.5. Mô phân sinh ngọn từ sự nuôi cấy khúc cắt sơ khởi chồi ở vị trí trung gian sau 10 ngày trên môi trường MS có bổ sung AIA 0,1 mg/l 50
Ảnh 3.6. Mô phân sinh ngọn từ sự nuôi cấy khúc cắt sơ khởi chồi ở vị trí trung gian sau 10 ngày trên môi trường MS có bổ sung BA 0,5 mg/l 51
Ảnh 3.7. Mô phân sinh ngọn từ sự nuôi cấy khúc cắt sơ khởi chồi ở vị trí trung gian sau 10 ngày trên môi trường MS bổ sung BA 1 mg/l 51
H 3.8. Mô phân sinh ngọn từ sự nuôi cấy khúc cắt sơ khởi chồi ở vị trí trung gian khi ngâm trong GA3 100 mg/l 1h sau 10 ngày trên môi trường MS 52
Ảnh 3.9 Mô phân sinh ngọn từ sự nuôi cấy khúc cắt sơ khởi chồi ở vị trí trung gian sau 10 ngày trên môi trường MS có bổ sung GA3 10mg/l 52

Ảnh 3.10. Mô phân sinh ngọn từ sự nuôi cấy khúc cắt sơ khởi chồi ở vị trí trung gian sau 10 ngày trên môi trường MS có bổ sung BA 1 mg/l và ANA 0,5mg/l . 54
Ảnh 3.11. Mô phân sinh ngọn từ sự nuôi cấy khúc cắt sơ khởi chồi ngọn ở vị trí trung gian sau 10 ngày trên môi trường MS có bổ sung BA 0,5 mg/l và ANA 0,5 mg/l . 54
Ảnh 3.12. Chồi từ sự nuôi cấy khúc cắt sơ khởi chồi ở vị trí trung gian sau 10 ngày trên môi trường MS có bổ sung BA 1 mg/l và AIA 0,1 mg/l . 59
Ảnh 3.13. Chồi từ sự nuôi cấy khúc cắt sơ khởi chồi ở vị trí trung gian sau 20 ngày trên môi trường MS có bổ sung BA 1 mg/l và AIA 0,1 mg/l . 59
Ảnh 3.14. Mô phân sinh ngọn từ sự nuôi cấy khúc cắt sơ khởi chồi ở vị trí trung gian sau 10 ngày trên môi trường MS có bổ sung BA 1 mg/l và AIA 0,1 mg/l . 60
Ảnh 3.15. Sơ khởi chồi hình thành từ khúc cắt thân Ananas comosus Merr sau 2 tuần nuôi cấy ở môi trường MS có bổ sung BA 4 mg/l và AIA 0,1 mg/l . 63
Ảnh 3.16. Cụm chồi từ khúc cắt thân Ananas comosus Merr trên môi trường MS có bổ sung BA 4 mg/l và AIA 0,1 mg/l sau 4 tuần nuôi cấy . 63
Ảnh 3.17. Cụm chồi từ khúc cắt thân Ananas comosus Merr trên môi trường MS bổ sung BA 4 mg/l và AIA 0,1 mg/l sau 6 tuần nuôi cấy 64
Ảnh 3.18. Sự tăng trưởng chồi từ sự nuôi cấy khúc cắt sơ khởi chồi ở vị trí trung gian MS nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung BA 1 mg/l AIA 0,1mg/l với hàm lượng N thay đổi sau 20 ngày . 66
Ảnh 3.19. Sự tăng trưởng chồi từ sự nuôi cấy chồi 4 tuần tuổi trong môi trường BA 1 mg/l AIA 0,1mg/l với hàm lượng N thay đổi sau 5 tuần. . 67
Ảnh 3.20. Cây con in vitro trên môi trường MS có bổ sung BA 4 mg/l và AIA 0,2 mg/l tách ra từ cụm chồi sau 6 tuần nuôi cấy . 70

Ảnh 3.21. A, B. Sơ khởi rễ hình thành từ chồi Ananas comosus Merr 6 tuần tuổi
trong môi trường AIA 2,5 mg/l sau 1 tuần nuôi cấy. 70
Ảnh 3.22. Cây con in vitro 16 tuần tuổi . 72
Ảnh 3.23. Cây con in vitro 16 tuần tuổi trước khi ra vườn ươm . 73
Ảnh 3.24. Cây con in vitro 16 tuần tuổi sau khi ra v??n ??m 20 ngày 73




LỜI MỞ ĐẦU

Dứa (khóm) là một trong ba loại cây ăn quả hàng đầu (chuối, dứa, cam quýt) rất được ưa chuộng ở Việt Nam và trên thế giới. Năm 1961 sản lượng dứa trên thế giới khoảng 3 triệu tấn, đến năm 2001 đạt hơn 13 triệu tấn. Một số nước có sản lượng dứa cao như Thái Lan (2.300.000 tấn), Philippin (1.571.904 tấn) hay Brazil (1.442.300 tấn) (FAO, 2002). Năm 2004, với diện tích 43.350 ha sản lượng 422.251 tấn, Việt Nam cũng là một trong những nước có sản lượng dứa cao nhưng chủ yếu tiêu thụ trong nước do phẩm chất trái, quá trình chế biến
Dứa là loại cây dễ trồng, chịu hạn cao, ít bị sâu bệnh, không kén đất. Dứa tươi chứa nhiều vitamin A, vitamin B, rất giàu vitamin C và các loại khoáng như: Fe, Ca, Cu, P , ít đường, chất béo, đặc biệt là có bromelin giúp tiêu hóa rất tốt (Wooster và Blank, 1950 trong Trần Thế Tục, 2002), chữa các vết thương, vết bỏng, làm mau liền sẹo (Võ Văn Chi, 1977).
Đã có nhiều nghiên cứu khác nhau về cây dứa: vi nhân giống, sự phát sinh cơ quan, sự tái sinh cây từ tế bào trần, từ mô sẹo với mục đích nâng cao phẩm chất, năng suất, rút ngắn thời gian sinh trưởng. Nhiều phương pháp được áp dụng nhưng tập trung chủ yếu vào nghiên cứu in vitro. Nguyên liệu nuôi cấy in vitro ở cây dứa chủ yếu là chồi, có thể từ chồi thân, chồi cuống, chồi ngọn hay chồi ngầm dưới mặt đất (Akbar và cộng sự, 2003).
Đề tài “ Sự phát triển chồi in vitro ở cây dứa Ananas comosus Merr dưới tác dụng của auxin, cytokinin và sự thay đổi hàm lượng nitrogen trong môi trường nuôi cấy “ được thực hiện với mục đích tìm hiểu sự phát triển chồi ở cây dứa và đặc biệt là vai trò của auxin, cytokinin và hàm lượng nitrogen trong môi trường nuôi cấy.