Luận Văn Sử dụng số hóa chất cải thiện hiệu quả ly trích DNA từ lông

TÓM TẮT KHÓA LUẬN

Đề tài được tiến hành từ ngày 14 – 02 – 2006 đến ngày 30 – 07 – 2006 tại


Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh.


Trong các thí nghiệm sinh học phân tử, người ta thường sử dụng mẫu máu, da,


cơ để ly trích DNA. Tuy nhiên, nhiều khi ta không thể có những loại mẫu đó, ví dụ


trong khoa học hình sự hay khi nghiên cứu về những loài tiệt chủng hay loài quý hiếm.


Ngoài ra, thu thập mẫu lông dễ dàng hơn thu thập các loại mẫu khác trên thú sống. Với


mục đích tìm một quy trình tối ưu cho ly trích DNA từ nhiều nguồn lông, đề tài được


tiến hành trên lông bò và lông heo. Kết quả ly trích được đánh giá dựa vào tỷ số OD


của mẫu DNA và hiệu suất thành công của PCR với đoạn mồi phân biệt giới tính và


đoạn mồi phát hiện gen halothane.


Kết quả đạt được như sau:

1. Dung dịch đệm ly trích chứa proteinase K và Ca2+ ở các nồng độ 2 mM, 6


mM và 10 mM cho DNA với tỷ số OD đạt khoảng 1,6 – 1,69. Trong đó, sản phẩm

PCR từ DNA của gốc lông bò khi ly trích với dung dịch đệm có 10 mM Ca2+ cho 1


băng dài 370 bp của gen giới tính.


2. DNA ly trích từ mẫu gốc lông heo và gốc lông bò không có sự khác biệt


nhau về tỷ số OD và hàm lượng .


3. DNA từ gốc lông bò (tỷ số OD trung bình 1,76) tinh sạch và có hàm


lượng cao hơn DNA từ ngọn lông (1,2).


4. DNA ly trích từ dung dịch đệm có DTT (tỷ số OD trung bình 1,84) tinh


sạch hơn DNA từ dung dịch đệm không có DTT (1,58).


5. Nồng độ CTAB trong quá trình ly trích có ảnh hưởng đến độ tinh sạch


của DNA. Không bổ sung CTAB cho tỷ số OD cao nhất (1,84 ); 0,06% CTAB cho


OD = 1,6; 0,2% CTAB cho OD = 1,3.


6. Sử dụng BSA cũng không có tác dụng trong việc cải thiện kết quả PCR


vì không nhân được đoạn DNA 655 bp của gen giới tính.


Nhìn chung, các hoá chất được bổ sung vào quy trình ly trích DNA và hỗn


hợp PCR chỉ cho đoạn sản phẩm PCR ngắn (370 bp) mà không có đoạn DNA dài


(655 bp) của gen giới tính. Đồng thời, các thí nghiệm đều không cho kết quả mong


muốn khi PCR phát hiện gen halothane trên 5 mẫu lông heo.


MỤC LỤC


TRANG


Lời cảm ơn .1


Tóm tắt khóa luận .iv


Mục lục .vi


Danh sách các chữ viết tắt . viii


Danh sách các bảng ix


Danh sách các hình và biểu đồ x


PHẦN I. MỞ ĐẦU 1


1.1. Đặt vấn đề .1


1.2. Mục tiêu và yêu cầu 1


1.2.1. Mục tiêu .1


1.2.2. Yêu cầu 2


PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3


2.1. Cấu trúc tổng quan của lông .3


2.2. Cấu trúc của lông bò và lông heo .3


2.3. Cấu trúc của melanin 4


2.4. Cấu tạo của keratin .5


2.5. Những công trình tách chiết DNA từ lông .5


2.6. Nguyên tắc của PCR .7


2.7. Nguyên tắc xác định gen giới tính và gen halothane 9


2.7.1. Nguyên tắc xác định gen giới tính .9


2.7.2. Nguyên tắc xác định gen halothane .9


PHẦN III. NỘI DUNG VÀ PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11


3.1. Nội dung nghiên cứu 11


3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành 11


3.3. Vật liệu .11


3.3.1. Nguồn mẫu chiết xuất DNA 11


3.3.2. Đoạn mồi .11


3.3.2.1. Đoạn mồi của gen xác định giới tính 11


3.2.2.2. Đoạn mồi của gen halothane 12


3.4. PHưƠNG PHÁP TIẾN HÀNH .12


3.4.1. Lấy và trữ mẫu .12


3.4.2. Tách chiết DNA .12


3.4.3. Đánh giá độ tinh sạch và hàm lượng DNA ly trích .15


3.4.4. Thực hiện phản ứng PCR 15


3.4.4.1. Multiplex PCR xác định giới tính 15


3.4.4.2. PCR xác định gen halothane .16


3.4.5. Điện di và quan sát kết quả 17


3.4.5.1. Chuẩn bị gel agarose 17


3.4.5.2. Kết quả điện di PCR .17


3.5 Xử lý số liệu 17


PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .18

4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ Ca2+ trong dung dịch đệm ly trích DNA 18


4.2. Thí nghiệm 2: So sánh DNA ly trích từ gốc và ngọn lông bò .19


4.3. Thí nghiệm 3: So sánh DNA ly trích từ lông heo và lông bò 20


4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát tác dụng của DTT trong việc phân cắt keratin khi ly trích


DNA .21


4.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát tác dụng của CTAB trong việc loại bỏ melanin 23


4.6. Thí nghiệm 6: Sử dụng BSA trong phản ứng PCR 23


PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 25


5.1. Kết luận .25


5.2. Đề nghị .25


VI. TÀI LIỆU THAM KHẢO .26


PHỤ LỤC 28