Luận Văn “ sử dụng kỹ thuật RFLP xác định sự đa dạng di truyền của hai dòng nấm Metarrhizium anisopliae và B

TÓM TẮT


Đề tài nghiên cứu:“ sử dụng kỹ thuật RFLP xác định sự đa dạng di truyền của


hai dòng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana” ký sinh trên côn trùng


gây hại ” được thực hiện từ ngày 20 tháng 2 năm 2005 đến ngày 15 tháng 8 năm 2005


tại trường Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.

Đối tượng nghiên cứu là nấm Metarrhizium anisopliae và nấm Beauveria


bassiana ký sinh trên côn trùng gây hại. Nấm này có tác dụng tiết ra độc tố làm ngừng


hoạt động của ruột, phá vở các hoạt động bình thường của côn trùng dẫn đến côn trùng


bị chết khô


Mục đích đề tài nhằm xác định đoạn gen gây độc Pr 1 của những dòng nấm


Metarrhizium anisopliae và vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 của nấm Beauveria bassiana


giúp chọn lọc đúng những dòng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana


có tính độc đảm bảo hoạt tính diệt côn trùng lâu dài và hiệu quả nhằm phục vụ cho sản


xuất nông nghiệp .


Các nội dung nghiên cứu bao gồm:


1. Phục hồi các chủng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassian


trên một số côn trùng gây hại .


2. Dùng kỹ thuật PCR phát hiện gen protease (Pr 1) và vùng ITS1 – 5.8S –


ITS2 liên quan đến tính độc của hai dòng nấm Metarrhizium anisopliae và


Beauveria bassiana


3. Sau khi thöïc hieän phaûn öùng PCR ta söû duïng kỹ thuật RFLP thực hiện phaûn öùng


enzyme caét giôùi haïn ñeå phaùt hieän söï ña hình trong phaïm vi vuøng IST1-5.8S-IST2 cuûa naám


Beauveria bassiana vaø vuøng Pr1 cuûa naám Metarrhizium anisopliae


4. Giải trình tự đoạn gen Pr 1 và vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 so sánh trình tự này


với các mẫu trên ngân hàng gen thế giới (genbank).


Kết quả thu được như sau:


1.Phục hồi các dòng nấm Metarrhizium và Beauveria trên môi PGA:

Sau quá trình phục hồi các nguồn nấm trên môi trường PGA(Potato-Glucose-


Agar),kết quả chúng tôi đã thu được một số dòng nấm sau khoảng 7-10 ngày nuôi cấy :


RNBT1.7 ,DONG 3.1, BXĐTG6, RMTĐ3 ,PULQ2, NNPT7, SR, BRVT6 ,BHBD6


,SCLLLA1, BDTN4 ,BDQ96 .


2.Nhân sinh khối các dòng nấm Metarrhizium và Beauveria trong môi trường


lỏng Czapek – Dox trong khoảng thời gian từ 3-5 ngày , thu được sinh khối nấm ,rửa


lại với nước cất rồi phơi khô , nghiền trong nitơ lỏng ,cuối cùng chúng tôi được nấm ở


0

dạng khô và chúng tôi bảo quản nấm -80 C cho đến khi sử dụng .


3.Tiến hành ly trích nấm đã bảo quản ở trên bằng dịch ly trích ,kết quả trích


được DNA của 12 dòng nấm Metarrhizium và Beauveria ,sau đó là tinh sạch DNA của


các dòng nấm Metarrhizium và Beauveria nhằm tạo sản phẩm sạch ,ít tạp trong sản


phẩm PCR.Sau tinh sạch vẫn giữ được DNA của 12 mẫu nấm.


4.Thực hiện phản ứng PCR trên các dòng nấm Metarrhizium và Beauveria , kết


quả thu được sản phẩm PCR của 6 dòng nấm Beauveria


5.Phân tích RFLP , thực hiện phản ứng cắt bằng enzyme cắt giới hạn trên 6


dòng nấm Beauveria ,enzyme cắt Alu I, Hae III trên các sản phẩm PCR .kếtquả chưa


nhận thấy rõ sự đa dạng di truyền của các dòng nấm do mức độ tương đồng giữa các


dòng nấm khá cao .Tuy nhiên thu được kích thước các band trên gel so với Ladder là


hoàn toàn trùng khớp với kích thước band DNA chuẩn của các dòng nấm Beauveria .

MỤC LỤC


CHưƠNG

TRANG

Trang tựa

Lời cảm tạ . iii

Tóm tắt .iv

Mụclục vi

Danh sách chữ viết tắt ix

Danh sách các bảng .x

Danh sách các hình xi


1. MỞ ĐẦU 1

1.1.Đặt vấn đề 1

1.2.Mục đích và yêu cầu đề tài .1

1.2.1.Mục đích 1

1.2.2.Mục tiêu 2

1.3.Yêu cầu nghiên cứu .2

2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3

2.1.Vai trò của biện pháp phòng trừ sinh học 3

2.2.Giới thiệu về nấm ký sinh 4

2.2.1.Giới thiệu về nấm Metarrhizium anisopliae 5

2.2.2.Giới thiệu về nấm Beauveria bassiana vuille .6

2.3.Hiệu quả phòng trừ bằng chế phẩm nấm .8

2.4.Sơ lược về phương thức xâm nhiễm 9

2.5.Hoạt tính sinh học 11

2.6.Một số nghiên cứu trong và ngoài nước .11

2.6.1.Nghiên cứu trong nước .11

2.6.2.Nghiên cứu ngoài nước 12

2.7.Vai trò của protease Pr1 và vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 14

2.8.Phản ứng PCR .14

2.8.1.Giới thiệu chung về PCR 14

2.8.2.Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả PCR .15

2.8.3.Các ứng dụng của phương pháp PCR 16

2.8.4. Những hạn chế của phương pháp PCR .16

2.9. Đọc trình tự bằng máy đọc tự động 17

2.10.Phân tích RFLP .17

3. VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

3.1.Thời gian và địa điểm 19

3.1.1.Thời gian 19

3.1.2.Địa điểm 19

3.2. Vật liệu và hóa chất 19

3.2.1.Vật liệu .19

3.2.1.1.Mẫu thí nghiệm .19

3.2.1.2.Các Primer dùng trong thí nghịêm .19

3.2.2.Hóa chất và môi trường .19

3.2.2.1.Các hóa chất dùng chiết tách DNA từ khối sợi nấm .19

3.2.2.2. Các hóa chất dùng trong điện di 20

3.2.2.3. Các hóa chất dùng trong phản ứng PCR .20

3.2.2.4.Môi trường .20

3.2.3.Các thiết bị chính 21

3.3.Nôi dung nghiên cứu .21

3.4.Phương pháp nghiên cứu 21

3.4.1.Phục hồi các chủng nấm .21

3.4.2.Chủân bị môi trường lỏng .22

3.4.3.Phương pháp ly trích DNA .22

3.4.4.Phương pháp tinh sạch DNA 23

3.4.5.Thực hiên phản ứng PCR .24

3.4.5.1.Nấm Metarrhizium anisopliae .24

3.4.5.2.Nấm Beauveria bassiana vuille .25

3.4.6.Điện di và đọc kết quả .26

3.4.6.1.Điện di trên gel agarose 26

3.4.6.2.Đọc kết quả điện di 26

3.4.7.Thành phần phản ứng đọc trình tự 27

3.4.7.1.Tinh sạch sản phẩm PCR 27

3.4.7.2.Thành phần phản ứng đọc trình tự 27

3.4.8.Tinh sạch sản phẩm đọc trình tự 28

3.4.9.Điện di và ghi nhân kết quả .29

3.4.10. Phân tích RFLP .29

4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

4.1. Kết quả phục hồi và nhân sinh khối nấm 30

4.2. Kết quả ly trích DNA .30

4.3. Kết quả tinh sạch DNA 32

4.4. Kết quả PCR .33

4.5. Kết quả phân tích RFLP .34

5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 36

5.1.Kết luận .36

5.2.Đề nghị 36

6. TÀI LIỆU THAM KHẢO 37