Thạc Sĩ Sinh tổng hợp enzym pectinase bởi nấm mốc từ nguồn phế liệu giàu pectin và một số ứng dụng

MỞ ĐẦU
Hằng năm, một lượng vật chất và năng lượng tồn tại ở dạng phế phụ liệu hữu
cơ có bản chất gluxit, protit được thải ra môi trường làm ảnh hưởng đến môi trường
sống của sinh vật.
Nhằm tiến tới và góp phần vào mục tiêu phát triển bền vững kinh tế xã hội
nước ta hiện nay và theo xu thế tiết kiệm năng lượng thì nguồn phế phụ liệu này sẽ
được tận dụng hoặc xử lý nhằm đạt hiệu quả kinh tế cao hơn và tránh ô nhiễm môi
trường sống.
Trong các phế liệu có khả năng tận dụng phải kể đến các phế liệu giàu
pectin thải ra từ các nhà máy chế biến rau quả đóng hộp, các cơ sở sản xuất nước
ép trái cây. Hiện tại, các sản phẩm giàu pectin thải ra từ các cơ sở sản xuất chưa
được tận dụng gây lãng phí, trong khi các nguyên liệu này có thể sử dụng để sản
xuất ra một số sản phẩm có ích.
Ngày nay, việc nghiên cứu tận dụng các phế phụ liệu công nông nghiệp góp
phần tiết kiệm nguồn tài nguyên, giảm thiểu ô nhiễm môi trường sống bằng việc
tạo ra những chất có hoạt tính sinh học và được ứng dụng trong lĩnh vực: y, dược,
công nghiệp, nông nghiệp, thực phẩm. Để tận dụng phế phụ liệu giàu pectin, chúng
tôi tiến hành đề tài khảo sát “Sinh tổng hợp enzym pectinase bởi nấm mốc từ
nguồn phế liệu giàu pectin và một số ứng dụng” bằng cách sử dụng các phế liệu
này làm cơ chất cảm ứng và cũng là nguồn dinh dưỡng chủ yếu, chiếm trên 50%
thành phần môi trường nuôi cấy.
2
Nội dung của luận văn tập trung vào các vấn đề cần nghiên cứu sau:
- Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng phế phụ liệu bổ sung vào môi trường nuôi
cấy đến khả năng tổng hợp enzym pectinase nấm mốc.
- Tiến hành khảo sát quá trình sinh tổng hợp enzyme pectinase bởi hai chủng nấm
mốc khác nhau là Aspergillus niger và Trichoderma ressei theo thời gian trên các
nguồn phế liệu khác nhau.
- Tiến hành thử nghiệm phối hợp hai chủng mốc trong quá trình sinh tổng hợp
pectinase để đánh giá khả năng cạnh tranh của hai chủng nấm mốc trên.
- Thu nhận chế phẩm enzym bằng các tác nhân tủa khác nhau, đánh giá hiệu suất
thu nhận chế phẩm enzym (CPE).
- Một số ứng dụng chế phẩm pectinase trong xử lý dịch ép trái cây.

MỤC LỤC Trang phụ bìa Tóm tắt Mục lục Danh mục các chữ viết tắt Danh mục các hình Danh mục các bảng Danh mục các biểu đồ Danh mục các đồ thị MỞ ĐẦU
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Tổng quan về pectin và phế liệu giàu pectin 4
1.1.1 Cơ chất pectin . 4
1.1.1.1 Phân loại pectin 4
1.1.1.2 Cấu tạo pectin 5
1.1.1.3 Tính chất chung của pectin . 6
1.1.2 Tổng quan về phế phụ liệu giàu pectin 7
1.1.2.1 Vỏ bưởi . 7
1.1.2.2 Bã cà rốt . 8
1.1.2.3 Bã táo . 8
1.1.2.4 Củ cải trắng 10
1.1.3 Tận dụng các phế liệu giàu pectin . 10
1.2 Enzym pectinase 11
1.2.1 Giới thiệu chung về enzym pectinase . 11
1.2.2 Phân loại và danh pháp của enzym pectinase 13
1.2.3 Cơ chế hoạt động của enzym pectinase . 15
1.2.3.1 Pectinesterase (PE) . 15
1.2.3.2 Enzym polygalacturonase (PG) 15
1.2.3.3. Pectate lyase (transeliminase) 18
1.3 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về enzym pectinase . 19
1.3.1 Nghiên cứu trong nước về pectinase 19
1.3.2 Các nghiên cứu ngoài nước 20
1.4 Cảm ứng sinh tổng hợp enzym . 22
1.5 Phương pháp nuôi cấy bề mặt sinh tổng hợp pectinase 25
1.6 Đặc điểm của chủng nấm mốc nuôi cấy sinh tổng hợp pectinase 27
1.6.1 Sơ lược về nấm mốc Aspergillus niger 27
1.6.2 Sơ lược về nấm mốc Trichoderma reesei 28
1.7 Ứng dụng của enzym pectinase 29
1.7.1 Ứng dụng enzym pectinase trong sản xuất nước quả . 30
1.7.2 Ứng dụng pectinase trong sản xuất rượu vang . 30
1.7.3 Ứng dụng petinase trong trích ly các dược liệu đông y 31
1.7.4 Ứng dụng pectinase trong chăn nuôi 32
1.7.5 Xử lý nước thải . 33
1.7.6 Cà phê và trà lên men 33
1.7.7 Công nghiệp vải sợi 33
CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1 Vật liệu 35
2.1.1 Chủng vi sinh vật nghiên cứu . 35
2.1.2 Vật liệu sử dụng làm môi trường nuôi nấm mốc tổng hợp pectinase 35
2.1.2.1 Bột vỏ bưởi khô 35
2.1.2.2 Bột bã cà rốt . 35
2.1.2.3 Bột bã táo . 36
2.1.2.4 Bột bã củ cải trắng . 36
2.1.2.5 Cám gạo . 36
2.1.2.6 Trấu 36
2.1.3 Môi trường nuôi cấy nấm mốc 36
2.1.3.1 Môi trường giữ giống 36
2.1.3.2 Môi trường hoạt hóa . 37
2.1.3.3 Môi trường nuôi cấy bán rắn khảo sát sinh tổng hợp enzym pectinase. 37
2.2 Các phương pháp nghiên cứu và phân tích sử dụng trong luận văn . 39
2.2.1 Xác định số tế bào trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu 40
2.2.2 Phương pháp nuôi cấy nấm mốc trên môi trường bán rắn . 40
2.2.3 Xác định pH 41
2.2.4 Xác định độ ẩm nguyên liệu . 41
2.2.5 Xác định hàm lượng tro và tổng chất hữu cơ 41
2.2.6 Định lượng pectin bằng phương pháp canxi pectat . 42
2.2.7 Xác định hàm lượng đường tổng số theo phương pháp Phenol . 43
2.2.8 Định lượng đường khử theo phương pháp Miller 44
2.2.9 Định lượng nitơ tổng theo nitơ Kjeldahl .và protein thô 45
2.2.10 Xác định hàm lượng chất xơ trong thực vật (cellulose) 46
2.2.11 Xác định hoạt độ pectinase theo phương pháp so màu với thuốc thử DNS (acid 3,5-dinitrosalicylic) . 47
2.2.12 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry 49
2.2.13 Phương pháp thu nhận chế phẩm enzym với các nhân tủa khác nhau . 49
2.2.14 Phương pháp thẩm tích Dialyse để loại muối . 50
2.2.15 Phương pháp khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt độ của enzym pectinase 50
2.2.16 Phương pháp khảo sát sự ảnh hưởng của pH lên hoạt độ của enzym pectinase 50
2.2.17 Phương pháp khảo sát sự thủy phân cơ chất pectin theo thời gian của enzym pectinase 51
2.2.18 Phương pháp ứng dụng pectinase làm trong nước ép trái cây . 51
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.1 Khảo sát một số thành phần có trong bã phế liệu 53
3.2 Khảo sát cảm ứng sinh tổng hợp enzym pectinase bởi nấm mốc . 54
3.3 Khảo sát sinh tổng hợp pectinase trên một số phế liệu giàu pectin 57
3.3.1 Khảo sát sinh tổng hợp pectinase của chủng nấm mốc Aspergillus niger trên các loại phế liệu khác nhau . 58
3.3.1.1 Hoạt độ pectinase của canh trường nuôi cấy Asp. niger trên bã cà rốt 58
3.3.1.2 Xác định hoạt độ pectinase của canh trường nuôi cấy Aspergillus niger trên môi trường có bổ sung phế liệu vỏ bưởi . 61
3.3.1.3 Xác định hoạt độ pectinase của canh trường nuôi cấy Aspergillus niger trên môi trường có bổ sung phế liệu bã táo . 64
3.3.1.4 Xác định hoạt độ pectinase của canh trường nuôi cấy Aspergillus niger trên phế liệu củ cải 67
3.3.2 Khảo sát sinh tổng hợp pectinase trên nguồn phế liệu khác nhau bởi chủng Tri. reesei . 69
3.3.2.1 Xác định hoạt độ pectinase của canh trường nuôi cấy Tri. reesei trên môi trường có bổ sung phế liệu bã cà rốt 70
3.3.2.2 Xác định hoạt độ pectinase của canh trường nuôi cấy Tri.reesei trên môi trường có bổ sung nguồn phế liệu vỏ bưởi . 71
3.3.2.3 Xác định hoạt độ pectinase của canh trường nuôi cấy Trichoderma reesei trên môi trường có bổ sung nguồn phế liệu bã táo 74
3.3.2.4 Xác định hoạt độ pectinase của canh trường nuôi cấy Trichoderma reesei trên nguồn phế liệu bã củ cải 76
3.3.3 Khảo sát sự sinh tổng hợp pectinase bằng cách phối trộn giữa hai chủng nấm mốc Tri. reesei và Asp. niger . 77
3.4 Khảo sát thu nhận chế phẩm enzym bởi tác nhân tủa khác nhau . 80
3.5 Thu nhận chế phẩm enzym từ canh trường nuôi cấy hai chủng nấm mốc Asp. niger và Tri.reesei trên các môi trường có bổ sung nguồn phế liệu khác nhau 81
3.5.1 Tỉ lệ thu nhận pectinase và hiệu suất hoạt độ enzym pectinase thu được từ canh trường với chủng Aspergillus niger có bổ sung phế liệu giàu pectin 82
3.5.2. Tỉ lệ thu nhận pectinase và hiệu suất hoạt độ enzym pectinase thu được từ quá trình lên men nhờ chủng Trichoderma reesei từ nguồn phế liệu khác nhau 84
3.6 Khảo sát chế phẩm enzym thu được từ hai chủng nấm mốc 87
3.6.1 Khảo sát đặc tính chế phẩm enzym thu được từ canh trường lên men bán rắn nhờ nấm mốc Aspergillus niger . 87
3.6.1.1 Khảo sát sự biến thiên hoạt độ CPE pectinase thu được từ canh trường nấm mốc Aspergillus niger ở nhiệt độ khác nhau 87
3.6.1.2 Khảo sát sự phụ thuộc hoạt độ CPE pectinase thu nhận từ Aspergillus niger vào môi trường phản ứng 89
3.6.1.3 Khảo sát khả năng thủy phân cơ chất pectin của CPE pectinase thu nhận từ chủng mốc Aspergillus niger theo thời gian 90
3.6.2 Khảo sát đặc tính của CPE pectinase thu được từ canh trường lên men bán rắn nhờ nấm mốc Trichoderma reesei . 93
3.6.2.1 Khảo sát nhiệt độ tối ưu của CPE pectinase thu được từ nấm mốc Trichoderma reesei . 93
3.6.2.2 Khảo sát sự phụ thuộc hoạt độ CPE pectinase thu nhận từ Tri.reesei vào môi trường phản ứng . 95
3.6.2.3 Khảo sát khả năng thủy phân cơ chất pectin của CPE pectinase thu nhận từ chủng mốc Trichoderma reesei . 96
3.7 Ứng dụng CPE pectinase xử lý nước ép quả 98
3.7.1 Ứng dụng chế phẩm pectinase xử lý nước ép dâu . 98
3.7.2 Ứng dụng chế phẩm pectinase xử lý nước quả khóm 103
3.7.3 Ứng dụng chế phẩm pectinase xử lý nước ép nho 107
CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
4.1 Kết luận 113
4.2 Đề nghị 114
Tài liệu tham khảo
Phụ lục 1 Đường chuẩn Phụ lục 2 Một số hình ảnh ghi nhận trong quá trình thực hiện luận văn