Thạc Sĩ Sản xuất β-CD bằng CGTase cố định

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC
Năm 2009

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i
MỤC LỤC ii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT iv
DANH MỤC BẢNG vii
LỜI MỞ ĐẦU ix

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 10
1.1. Tổng quan về Cyclodextrin 10
1.1.1. Tên gọi [10] . 10
1.1.2. Công thức [10, 23] . 10
1.1.3. Cấu trúc 11
1.1.4. Tính chất 12
1.1.5. Một số dẫn xuất của cyclodextrin [7, 9, 19] 15
1.1.6. Sản xuất β-CD [9, 23, 25] 15
1.1.7. Ứng dụng của Cyclodextrin [8, 9, 23] . 19
1.1.8. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 24
1.2. Tổng quan về enzym CGTase [7, 20] 25
1.2.1. Enzym 4-a-Glucanotransferase . 25
1.2.2. Tác động của 4-a-glucanotranferase [7, 19, 20, 23] . 26
1.2.3. Phân loại 4-a-glucanotranferase [7, 15] 26
1.3. Tổng quan về enzym cố định 32
1.3.1. Khái niệm về enzym cố định [15, 22] 32
1.3.2. Đặc điểm của enzym cố định [15, 26] . 32
1.3.3. Các ưu nhược điểm của enzym được cố định [15] 33
1.3.4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự cố định enzym [4] . 34
1.3.5. Các phương pháp cố định enzym [15, 21, 22] . 35
1.3.6. Vật liệu cố định enzym [15, 21] 43
1.3.7. Reactor (Bình phản ứng) [1] 48
1.3.8. Ứng dụng của enzym cố định [1, 17] 48

Chương 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 51

2.1. Bước cố định enzym CGTase 51
2.1.1. Vật liệu . 51
2.1.2. Phương pháp 52
2.2. Bước xác định hàm lượng và hoạt tính CGTase cố định 61
2.2.1. Phương pháp Bradford [12] . 61

2.2.2. Phương pháp Kaneko . 62
2.2.3. Xác định hoạt tính tái sử dụng của E sau cố định 66
2.3. Bước sản xuất β-CD [5] 66
2.3.1. Các giai đoạn sản xuất . 66
2.3.2. Định lượng β-CD . 67

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 70

3.1. Bước cố định CGTase 70
3.1.1. Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford 70
3.1.2. Xác định hoạt tính chế phẩm Toruzyme® 3.0L 71
3.1.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định CGTase
trên EuC 72
3.1.4. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định trên
Sepharose 83
3.1.5. Khảo sát các thông số cố định CGTase trên Chitosan . 86
3.1.6. Khảo sát hiệu suất tái sử dụng của CGTase cố định trên EuC 91
3.2. Bước sản xuất β-CD 91
3.3. Bàn luận 93
3.3.1. Đối với bước cố định . 93
3.3.2. Đối với bước sản xuất β-CD 93

Chương 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 94

4.1. Kết luận 94
4.1.1. Đối với bước cố định . 94
4.1.2. Đối với bước sản xuất β-CD 94
4.2. Đề nghị 94
4.2.1. Đối với bước cố định . 94
4.2.2. Đối với bước sản xuất β-CD 95

TÀI LIỆU THAM KHẢO 96




DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Cấu trúc của α, β và γ-cyclodextrin 11
Hình 1.2. Cấu trúc thứ cấp của β-CD . 11
Hình 1.3. Cyclodextrin tạo phức với một phân tử ngoại lai . 14
Hình 1.4. Tóm tắt quy trình sản xuất cyclodextrin dùng dung môi . 17
Hình 1.5. Quy trình sản xuất cyclodextrin không dùng dung môi . 19
Hình 1.6. Cyclodextrin tạo phức với thuốc ứng dụng trong ngành dược 20
Hình 1.7. Enzym CGTase từ Bacillus 25
Hình 1.8. Enzym CGTase tạo ra các loại cyclodextrin từ tinh bột . 27
Hình 2.1. Sơ đồ các bước cố định CGTase trên EuC theo phương pháp hấp phụ . 53
Hình 2.2. Sơ đồ các bước hoạt hóa EuC theo phương pháp cộng hóa trị 55
Hình 2.3. Sơ đồ các bước cố định CGTase trên EuC họat hóa theo phương pháp
cộng hóa trị . 55
Hình 2.4. Sơ đồ các bước cố định CGTase trên sepharose theo phương pháp hấp phụ 56
Hình 2.5. Sơ đồ các bước cố định CGTase trên Chitosan theo phương pháp hấp phụ . 58
Hình 2.6. Sơ đồ các bước cố định CGTase trên Chitosan theo phương pháp cộng hóa trị . 61
Hình 2.7Sơ đồ các bước sản xuất β-CD . 69
Hình 3.1. Độ hấp thu theo nồng độ albumin 70
Hình 3.2. Đường chuẩn độ hấp thu theo nồng độ protein 71
Hình 3.3. Độ hấp thu theo nồng độ β-CD 71
Hình 3.4. Đường chuẩn độ hấp thu theo nồng độ theo β-CD . 72
Hình 3.5. Hiệu suất cố định trên EuC theo thời gian, tỷ lệ chất mang/enzym, pH cố định 75
Hình 3.6. Hiệu suất hoạt tính cố định trên EuC theo thời gian, tỷ lệ chất
mang/enzym, pH cố định 76
Hình 3.7. Hiệu suất cố định theo độ pH và thời gian lắc với tỷ lệ chất
mang/enzym 1.1 bằng phương pháp cộng hóa trị trên EuC . 77

Hình 3.8. Hiệu suất hoạt tính cố định theo độ pH và thời gian lắc với tỷ lệ chất
mang/enzym 1.1 bằng phương pháp cộng hóa trị trên EuC . 79
Hình 3.9. Hiệu suất cố định theo phương pháp cố định và thời gian lắc với nồng
độ đệm la` 0.1M trên EuC 81
Hình 3.10. Hiệu suất hoạt tính cố định theo phương pháp cố định và thời gian
lắc với nồng độ đệm 0,1M trên EuC . 82
Hình 3.11. EuC trước khi cố định (a), sau khi cố đinh hấp phụ (b) và cộng hóa trị (c) 83
Hình 3.12. Hiệu suất cố định trên Sepharose theo độ pH, thời gian lắc và loại Sepharose 84
Hình 3.13. Hiệu suất hoạt tính cố định trên Sepharosetheo độ pH, thời gian lắc,loại Sepharose 86
Hình 3.14. Sepharose trước (a) và sau (b) khi cố định . 86
Hình 3.15. Hiệu suất cố định trên Chitosan theo phương pháp cố định, pH đệm và thời gian lắc . 87
Hình 3.16. Hiệu suất hoạt tính cố định trên Chitosan theo phương pháp cố định, pH đệm và thời gian lắc . 89
Hình 3.17. Chitosan trước (a) và sau (b) khi cố định, Hình (b) hình bên trái làchitosan cố định theo phương pháp hấp phụ, hình bên phải là
chitosan cố định theo phương pháp cộng hóa trị 90
Hình 3.18. β-CD trước (trái) và sau (phải) chưng cất và lọc 92
Hình 3.19. β-CD của Rhodia (a) và β-CD sản xuất được . 92


DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Tóm tắt tính chất vật lý của các cyclodextrin quan trọng nhất. . 12
Bảng 1.2. Một số tính chất về cấu trúc của CD 13
Bảng 1.3. Các tác nhân dùng sản xuất cyclodextrin trong quy trình dung môi . 17
Bảng 1.4. Một số dạng chế phẩm có sử dụng CD 21
Bảng 1.5. Tính chất enzym CGTase của một số chủng 28
Bảng 1.6. Một số tính chất của sepharose 47
Bảng 2.1. Cách pha các giai mẫu cho đường chuẩn xác định nồng độ protein 61
Bảng 2.2. Cách pha giai mẫu cho đường chuẩn định lượng β-CD . 63
Bảng 2.3. Cách pha giai mẫu cho quá trình xác định hoạt tính enzym 64
Bảng 3.1. Độ hấp thu theo nồng độ albumin 70
Bảng 3.2. Nồng độ protein ban đầu dựa theo đường chuẩn . 71
Bảng 3.3. Độ hấp thu theo nồng độ β-CD 71
Bảng 3.4. Hoạt tính riêng chế phẩm enzym . 72
Bảng 3.5. Hiệu suất cố định EuC theo thời gian, tỷ lệ chất mang/enzym, độ pH . 74
Bảng 3.6. Hiệu suất hoạt tính cố định trên EuC theo thời gian, tỷ lệ chất
mang/enzym, pH pH cố định 75
Bảng 3.7. Hiệu suất cố định EuC theo độ pH và thời gian lắc với tỷ lệ chất
mang/enzym 1.1 bằng phương pháp cộng hóa trị . 76
Bảng 3.8. Hiệu suất hoạt tính cố định theo độ pH và thời gian lắc với tỷ lệ chất
mang/enzym 1.1 bằng phương pháp cộng hóa trị trên EuC . 77
Bảng 3.9. Hiệu suất cố định theo phương pháp cố định và thời gian lắc với
nồng độ đệm là 0.1M trên EuC 80
Bảng 3.10. Hiệu suất hoạt tính cố định theo phương pháp cố định và thời gian
lắc với nồng độ đệm 0,1M trên EuC . 81
Bảng 3.11. Hiệu suất cố định trên Sepharose theo độ pH, thời gian lắc và loạiSepharose 84
Bảng 3.12. Hiệu suất hoạt tính cố định trên Sepharosetheo độ pH, thời gian lắc, loại Sepharose . 85

Bảng 3.13. Hiệu suất cố định trên Chitosan theo phương pháp cố định, pH đệm
và thời gian lắc 87
Bảng 3.14. Hiệu suất hoạt tính cố định trên Chitosan theo phương pháp cố
định, pH đệm và thời gian lắc . 88
Bảng 3.15. Hiệu suất hoạt tính sau 5 lần tái sử dụng của CGTase cố đinh trênEuC . 91
Bảng 3.16. Hiệu suất sản xuất và hiệu suất thu được trung bình của β-CD . 92


LỜI MỞ ĐẦU


Trên thế giới, cyclodextrin đã được ứng dụng từ rất lâu và trong nhiều lĩnh vực đa dạng do cấu trúc đặc biệt của chúng. Trong công nghiệp thực phẩm được dùng để che giấu mùi, vị khó chịu, để ổn định và bảo vệ các thành phần chức năng như acid amin, vitamin trong thực phẩm, làm phụ gia độn, tạo độ nhớt, Trong mỹ phẩm chúng được dùng để tạo ra các dạng hương liệu, nước hoa có mùi bền, Trong công nghiệp hóa CD được ứng dụng trong việc tách chiết các đồng phân quang học, làm cột sắc ký hay giá mang của phản ứng. Đối với ngành dược CD là một tá dược quan trọng giúp tăng độ tan của các dược chất không tan trong nước, giúp tăng độ hấp thu và sinh khả dụng hoặc kiểm soát tốc độ phóng thích thuốc, ngoài ra nó còn giúp che dấu mùi, vị khó chịu của nhiều hoạt chất. Tuy nhiên, tá dược này rất đắt tiền và hiện nay phải nhập ngoại hoàn toàn.[11, 16, 18, 24]

Việc sản xuất CD hiện nay được thực hiện duy nhất bằng cách chuyển hóa tinh bột với xúc tác của enzym cyclodextrin glucanotransferase (CGTase). Nhưng nếu sản xuất β-CD theo phương pháp cổ điển là dùng enzym tự do thì sản phẩm không đảm bảo độ tinh sạch. Mặt khác, việc sử dụng CGTase theo phương pháp cổ điển chỉ sử dụng enzym 1 lần gây lãng phí. Do đó việc cố định CGTase trên giá mang không những giúp tiết kiệm được chi phí sản xuất (tăng sự ổn định và khả năng thu hồi enzym) và β-CD thu được tinh khiết hơn (enzym không lẫn vào sản phẩm) mà còn là một hướng đi mới nhiều tiềm năng tiếp cận về mặt công nghệ kỹ thuật, nhất là công nghệ enzym.

Việc sản xuất được β-cyclodextrin trong nước sẽ giúp tự chủ được nguồn nguyên liệu làm thuốc và tạo điều kiện để công nghiệp dược phẩm trong nước ứng dụng bào chế các chế phẩm có chất lượng cao, cạnh tranh được với các sản phẩm ngoại nhập. Mặt khác, nguyên liệu để sản xuất β-cyclodextrin từ tinh bột giúp tạo ra giá trị gia tăng mới cho tinh bột, qua đó thúc đẩy sự phát triển ngành công nghiệp chế biến nông sản.


Trên cơ sở đó chúng tôi tiến hành đề tài “Sản xuất β-CD bằng CGTase cố định” nhằm khảo sát các loại chất mang, các phương pháp cố định khác nhau v.v để đạt hiệu quả tối ưu nhất cho quá trình sản xuất.