Luận Văn Sản xuất bộ kit tách chiết dna và bộ kit pcr phát hiện gen halothan trên heo

2


TÓM TẮT KHÓA LUẬN

Đề tài được thực hiện từ ngày 28-02-2006 đến ngày 28-07-2006 tại Trung Tâm


Phân Tích Thí Nghiệm Trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.


Gen halothan là gen có những tác động quan trọng đến phẩm chất thịt, sự sinh


trưởng và sinh sản của heo. Do đó, sản xuất bộ kit tách chiết DNA và bộ kit PCR để


phát hiện gen halothan trong đàn heo giống một cách nhanh chóng, tiện lợi, hiệu quả.


Quá trình thực hiện đề tài đạt được những kết quả sau:


1. Rút ngắn thời gian tách chiết DNA: Giảm thời gian ủ mẫu trong dung dịch phân


giải tế bào từ 1 giờ còn 30 phút, giảm thời gian tủa DNA lần 1 từ 2 giờ còn 1 giờ,


không thực hiện giai đoạn tủa DNA lần 2, thực hiện việc hòa tan DNA trong TE trong


2 giờ thay vì để qua đêm. Độ tinh sạch và hàm lượng DNA ở các thí nghiệm khác biệt


không có ý nghĩa so với độ tinh sạch và hàm lượng DNA tách chiết theo qui trình của


Lê Thị Thu Phương (2004).


2. Thiết lập được bộ kit tách chiết DNA cho 100 mẫu xét nghiệm. Thành phần bộ kit


gồm có 5 dung dịch. Độ tinh sạch, hàm lượng DNA và hiệu quả phản ứng PCR của


DNA tách chiết theo bộ kit khác biệt không có ý nghĩa so với qui trình của Lê Thị Thu


Phương (2004). Nhưng thời gian thực hiện công việc tách chiết DNA theo bộ kit ngắn


hơn (5 giờ so với 24 giờ). Có thể dùng bộ kit để tách chiết DNA từ mô cơ, mô máu,


o

da. Bộ kit tách chiết DNA có thể bảo quản ở 4 C trong 3 tháng.


3. Thiết lập bộ kit PCR phát hiện gen halothan cho 10 phản ứng. Nồng độ glycerol


o

20% trong Master Mix 2X sau 1 tháng bảo quản ở 4 C cho hiệu quả PCR cao hơn so


với nồng độ glycerol 10% (100% so với 20%). Bảo quản Master Mix 2X ở hai nhiệt


o o

độ 4 C và 10 C sau 1 tháng đều cho tỷ lệ thành công phản ứng PCR là 100%.


4. Bộ kit PCR halothan phát hiện gen halothan với nồng độ DNA mẫu tối thiểu 1ng.


5. Bộ kit PCR halothan dùng để phát hiện gen halothan trên nhiều nguồn mẫu khác


nhau như cơ vân, máu, da.

3


MỤC LỤC


NỘI DUNG TRANG

Bìa .i

Trang tựa ii

Lời cảm tạ iii

Tóm tắt khóa luận .iv

Mục lục v

Danh sách các chữ viết tắt .vii

Danh sách các bảng . viii

Danh sách các hình và biểu đồ .ix

PHẦN I. MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu và yêu cầu .2

1.2.1 Mục tiêu 2

1.2.2 Yêu cầu .2

PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3

2.1 Khái quát về gen halothan và cách phát hiện 3

2.1.1 Gen halothan .3

2.1.2 Ảnh hưởng của gen halothan đến phẩm chất thịt .3

2.1.3 Ảnh hưởng của gen halothan đến sức sinh sản .5

2.1.4 Những tác động tích cực của gen halothan .5

2.1.5 Cách phát hiện gen halothan .6

2.2 Phương pháp tách chiết DNA từ tế bào động vật và kỹ thuật PCR 7

2.2.1 Phương pháp tách chiết DNA từ tế bào động vật .7

2.2.2 Định lượng DNA bằng quang phổ kế .8

2.2.3 Phương pháp PCR 9

2.2.3.1 Nguyên tắc của phản ứng PCR 9

2.3 Enzym cắt giới hạn 11

2.4 Nguyên tắc tạo kit tách chiết DNA và kit PCR .13

2.4.1 Kit là gì ? .13

2.4.2 Nguyên tắc tạo kit .13

2.4.3 Kit tách chiết DNA .13

2.4.4 Kit thực hiện phản ứng PCR .14

2.5 Tình hình sản xuất kit trên thế giới và Việt Nam 16

PHẦN III. NỘI DUNG VÀ PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành 17

3.2 Nội dung nghiên cứu .17

3.2.1 Tối ưu hóa qui trình tách chiết DNA 17

3.2.2 Tạo kit tách chiết DNA 17

3.2.3 Tạo kit PCR để phát hiện gen halothan trên heo 17

3.3 Vật liệu và hóa chất .17

3.3.1 Nguồn mẫu chiết xuất DNA .17

3.3.2 Các primer sử dụng .18

4


3.3.2.1 Đối với gen trên nhiễm sắc thể giới tính của bò 18

3.3.2.2 Đối với gen thụ thể estrogen trên heo 18

3.3.2.3 Đối với gen halothan trên heo .18

3.3.3 Hóa chất 19

3.3.3.1 Hóa chất dùng trong tách chiết DNA 19

3.3.3.2 Hóa chất dùng trong điện di 19

3.3.3.3 Hóa chất dùng trong phản ứng PCR 19

3.3.3.4 Hóa chất dùng trong phản ứng cắt enzyme giới hạn HhaI 19

3.3.4 Thiết bị và dụng cụ .19

3.4 Phương pháp tiến hành 19

3.4.1 Lấy và bảo quản mẫu 19

3.4.2 Thiết lập bộ kit tách chiết DNA .19

3.4.2.1 Tách chiết DNA từ cơ vân (Lê Thị Thu Phương, 2004) (qui trình I) 19

3.4.2.2 Phương pháp tối ưu hóa qui trình tách chiết DNA 21

3.4.2.3 Xây dựng bộ kit tách chiết DNA .23

3.4.2.4 Hiệu quả của bộ kit tách chiết DNA đối với mô máu và da .24

3.4.2.5 Thực hiện phản ứng PCR 25

3.4.3 Thiết lập bộ kit PCR phát hiện gen halothan trên heo 27

3.4.3.1 Thiết lập thành phần bộ kit PCR và qui trình dùng bộ kit PCR .27

3.4.3.2 Khảo sát một số đặc tính của bộ kit PCR halothan .29

3.4.4 Cắt enzym giới hạn .30

3.4.5 Điện di và quan sát kết quả .30

3.4.5.1 Chuẩn bị gel agarose 1,5 % và 2 % .30

3.4.5.2 Điện di và đọc kết quả .30

3.5 Xử lý số liệu 30

PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .31

4.1 Kết quả tối ưu hóa qui trình tách chiết DNA .31

4.1.1 Giảm thời gian ủ mẫu trong dung dịch phân giải tế bào .31

4.1.2 Giảm thời gian tủa DNA lần 1 32

4.1.3 Không thực hiện giai đoạn tủa DNA lần 2 .32

4.1.4 Giảm thời gian hòa tan DNA trong TE .33

4.2 Kết quả thiết lập bộ kit tách chiết DNA 34

4.2.1 So sánh hiệu quả tách chiết DNA theo qui trình bộ kit và qui trình I .34

4.2.1.2 Kết quả thực hiện phản ứng PCR 35

4.2.2 Thử nghiệm tính ổn định của bộ kit ly trích DNA từ cơ vân 38

4.3 Kết quả thiết lập bộ kit PCR phát hiện gen halothan 39

4.3.1 Kết quả khảo sát nồng độ glycerol trong Master Mix 2X 39

4.3.2 Kết quả khảo sát nhiệt độ bảo quản Master Mix 2X 41

4.3.3 Kết quả khảo sát độ nhạy của bộ kit PCR halothan 42

4.3.4 Hiệu quả của bộ kit PCR halothan với DNA tách chiết từ máu và da 44

4.3.5 Hiệu quả kinh tế của bộ kit tách chiết DNA và bộ kit PCR halothan .46

PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 48

5.1 Kết luận 48

5.2 Đề nghị 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO .49

PHỤ LỤC 52