Luận Văn Quy trình tách chiết DNA từ lông heo

Việc ly trích DNA từ mẫu máu, mẫu da, mẫu cơ đã trở nên quen thuộc trong các thí nghiệm sinh học phân tử trước đây và hiện nay. Tuy nhiên, nhiều khi chúng ta không thể có những loại mẫu đó, ví dụ trong khoa học hình sự, trong khảo cổ học, hay
khi nghiên cứu về những loài tiệt chủng hay loài quý hiếm, ta chỉ có được mẫu lông hay tóc. Do đó, việc lấy mẫu lông hay tóc và ly trích DNA từ loại mẫu này trở nên rất cần thiết trong những trường hợp này.
Ngoài ra, việc thu thập mẫu lông dễ dàng hơn thu thập các loại mẫu khác (như máu, da, cơ ) trên thú sống. Chúng ta có thể nhổ hoặc cắt một vài lông trên thú một cách dễ dàng mà không phải giết mổ hay gây ra stress cho thú sống. Việc ly trích DNA
từ lông sẽ mở rộng ra cho ly trích DNA từ các cấu trúc tương tự lông như móng, mỏ, da, xương
Với mục đích tìm một quy trình tối ưu cho ly trích DNA từ nhiều nguồn lông, từ nhiều vị trí trên sợi lông và xác định sự xuất hiện của gen halothane, đề tài được tiến hành trên lông heo. Kết quả ly trích được đánh giá dựa vào tỷ số OD của mẫu DNA và hiệu suất thành công của PCR với đoạn mồi phát hiện gen halothane.
Kết quả đạt được như sau:
1. Sử dụng buffer ly trích chứa proteinase K ở các nồng độ 0,8 mg/ml, 1 mg/ml và 1,2 mg/ml đều cho chất lượng DNA tốt với tỷ số OD từ 1,75 – 1,84.
2. DNA được ly trích với DTT ở nồng độ 50 mM khá tinh sạch (OD = 1,65) và thành công khi được dùng làm nguồn mẫu cho phản ứng PCR.
3. Sử dụng CTAB 0,2% cho DNA tinh sạch (tỷ số OD trung bình là 1,80) và phản ứng PCR khuếch đại được gen halothan ở nồng độ CTAB 0,2%.
4. Vị trí gốc lông cho DNA ly trích tinh sạch nhất (OD = 2,05), tiếp theo là vị trí thân lông (OD = 1,84), cả sợi lông (OD = 1,75) và vị trí ngọn lông (OD = 1,4).
Phản ứng PCR khuếch đại gen halothane cho tỷ lệ thành công cao nhất đối với mẫu gốc lông (70%), tiếp theo là mẫu thân lông (60%) và cả sợi lông (50%). Phản ứng PCR không thành công đối với mẫu ngọn lông.
1.1. Đặt vấn đề
Công nghệ sinh học đang ngày càng thể hiện tầm quan trọng trong rất nhiều ngành khoa học, trong đó có ngành chăn nuôi. Việc áp dụng kỹ thuật gen trong nghiên cứu di truyền đã làm tăng hiệu quả của việc cải thiện giống vật nuôi. Một vấn đề đặt ra cho những kỹ thuật gen này là khả năng tách chiết DNA từ nhiều nguồn mẫu khác nhau để đảm bảo độ tinh sạch và giữ nguyên cấu trúc DNA. Tách chiết DNA từ máu, thịt, cơ rõ ràng không phức tạp và dễ thành công. Các loại mẫu này thường được dùng trong hầu hết các nghiên cứu. Tuy nhiên, một số nguồn mẫu khác như lông, da, xương, móng cũng cần được quan tâm. Lông có thể là nguồn DNA cho những nghiên cứu không ảnh hưởng đến cơ thể sống. Tuy nhiên, lông chứa một lượng rất nhỏ DNA, do đó tìm ra một phương pháp để tách chiết DNA từ lông là hết sức quan trọng.
Vấn đề quan tâm nhất hiện nay đối với mẫu lông là nó có lượng nhỏ DNA, chứa nhiều protein ức chế và quy trình tách chiết không đặc hiệu. Do đó, hoàn thiện quy trình tách chiết DNA từ lông cho những thí nghiệm xa hơn là cần thiết. Từ việc thử nghiệm những quy trình ly trích, một bộ kit có thể được tạo ra sẽ giúp việc tách chiết được thực hiện nhanh và có thể được thương mại hóa.
Sự phát triển của ngành chăn nuôi hiện nay đặt ra những vấn đề nóng bỏng và cấp bách. Đó là ảnh hưởng của điều kiện nuôi lên năng suất vật nuôi, chất lượng sản phẩm chăn nuôi, nhu cầu ngày càng tăng của con người, vấn đề lợi nhuận Để đáp ứng yêu cầu trên, các biện pháp chọn lọc và phối giống đã không ngừng được áp dụng. Tuy nhiên, trong quá trình chọn lọc, một tình trạng cần quan tâm đó là hội chứng nhạy cảm với stress. Hội chứng này được điều khiển bởi gen halothane, chi phối nhiều tính trạng về tăng trưởng, phẩm chất quầy thịt, năng suất sinh sản đã gây nhiều thiệt hại cho nhà chăn nuôi. Heo nhạy cảm stress có ưu điểm là tỷ lệ nạc cao, mỡ lưng thấp, hệ số chuyển biến thức ăn tốt nhưng có nhược điểm là khả năng sinh sản kém, tỷ lệ thịt PSE cao và tỷ lệ chết sau vận chuyển cao. Như vậy, một gen chi phối nhiều tính trạng, vừa có lợi vừa không có lợi. Tùy mục đích sử dụng mà người ta sẽ loại bỏ hay giữ lại 2 gen này. Cho nên, việc phát hiện sớm, nhanh chóng, chính xác gen halothane ở thú trước khi đưa vào sử dụng là rất cần thiết.
Tôi đã tiến hành đề tài “ Xác định quy trình ly trích DNA từ lông heo”.
1.2. Mục tiêu và yêu cầu
1.2.1. Mục tiêu
- Xác định quy trình tách chiết DNA từ lông heo.
- Tìm ra vị trí tốt nhất trên sợi lông heo để ly trích DNA.
1.2.2. Yêu cầu
- Khảo sát nồng độ các hoá chất để cải tiến quy trình ly trích DNA từ lông heo.
- Kiểm tra hiệu quả quy trình ly trích thông qua đo OD và phản ứng PCR.
- Áp dụng quy trình ly trích DNA lên các vị trí khác nhau của sợi lông heo.
PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Cấu trúc của lông
2.1.1. Cấu trúc tổng quan
Lông gồm 3 lớp chính: lớp tủy ở trung tâm, lớp vỏ ở giữa và lớp sừng bao bên ngoài. Mỗi lớp gồm những tế bào được phân hóa từ tế bào mầm trong nang lông.
Trong lớp tủy và lớp vỏ có những hạt sắc tố dạng trứng gọi là melanin. Melanin không tách khỏi DNA bởi những quy trình ly trích thông thường, nó được biết là yếu tố ức chế phản ứng PCR (theo McNevin và cs, 2005).
Yếu tố cấu trúc chính của lông là keratin. Xét theo chiều dài, lông là một cấu trúc bị keratin hoá từ gốc dần lên ngọn. Càng đi xa khỏi gốc thì mức độ keratin hoá càng mạnh, các tế bào mất dần DNA của mình và trở thành một chuỗi protein ở phần
ngọn. Phần gốc lông còn chứa nhiều tế bào còn sống (Frandson và ctv, 1969; dẫn liệu từ Nguyễn Văn Út, 2005). Ở độ ẩm thấp, lông chứa hơn 90% dạng protein này. Trong lớp vỏ, những sợi keratin được gắn với nhau bởi những protein liên kết keratin nhiều sulfur (KAP). Có 2 loại protein keratin biểu hiện ở thú: loại 1 chứa chuỗi polypeptide axit và loại 2 chứa chuỗi polypeptide bazơ.
2.1.2. Cấu trúc của melanin
Có 2 loại melanin: melanin nâu đen gọi là eumelanin; melanin đỏ vàng gọi là pheomelanin. Melanin được tổng hợp từ tyrosine.
Eumelanin từ lâu được nghĩ gồm các polymer như 5,6–dihydroxyindol acid (DHI) và 5,6–dihydroxyindole-2-carboxylic acid (DHICA) liên kết chéo với nhau. Tuy nhiên, những nghiên cứu gần đây về đặc tính dẫn điện của melanin chỉ ra rằng melanin
có thể gồm nhiều oligomer cơ bản bám dính theo một vài cơ chế nào đó. Vì vậy, cấu trúc phân tử tự nhiên chính xác của melanin vẫn còn là chủ đề đang được nghiên cứu.
Eumelanin được tìm thấy ở da, tóc. Đối với người, eumelanin nhiều ở người có màu da tối, màu tóc vàng, xám, đen và nâu. Có 2 loại eumelanin, được phân biệt bởi một đoạn trên mạch polymer của chúng. Đó là eumelanin đen và eumelanin nâu. Một lượng nhỏ eumelanin đen cùng với sự vắng mặt của những hạt sắc tố khác sẽ tạo thành màu tóc xám. Một lượng nhỏ eumelanin nâu cùng với sự vắng mặt của những hạt sắc tố khác sẽ tạo thành màu tóc vàng.
Pheomelanin cũng được tìm thấy ở da và tóc. Pheomelanin có nhiều ở người có màu da sáng và màu tóc đỏ. Pheomelanin cũng có thể trở thành tác nhân gây ung thư khi chịu tác động của tia UV. Về mặt hoá học, pheomelanin khác eumelanin ở cấu
trúc oligomer kết hợp với L-cysteine.
Dưới kính hiển vi, melanin có màu nâu, không khúc xạ và có lớp hạt với rất nhiều hạt nhỏ đường kính < 800 nm. Hỗn hợp loãng kali permanganate (KMnO4) là một phương pháp tẩy trắng melanin có hiệu quả.
2.1.3. Cấu trúc của keratin
Theo Eggling (2001, 2003), keratin thuộc nhóm protein cấu trúc, là những protein dạng sợi. Keratin hình thành màng bảo vệ cho toàn bộ động vật có xương sống: da, lông, tóc, vuốt, móng, sừng, vảy, mỏ. Đơn vị cơ bản của lông là một sợi protein dài hình thành theo cấu trúc xoắn alpha bậc hai. Ba trong số những protein xoắn alpha xoắn quanh một sợi khác hình thành nên cấu trúc gọi là tiền fibrin. Một sợi fibrin được tạo từ bảy tiền fibrin. Sau đó, hàng trăm sợi fibrin gắn vào một loại protein
dạng keo để hình thành nên sợi fibrin lớn. Những sợi fibrin lớn này được gắn vào tế bào lông chết.
Keratin là một họ protein cấu trúc sợi, dai và không hoà tan. Keratin ở dạng cấu trúc cứng nhưng không bị khoáng hoá, được tìm thấy ở bò sát, chim, lưỡng cư và động vật có vú. Keratin cạnh tranh tính bền sinh học với chitin.
Có nhiều loại keratin, đôi khi chỉ trong một động vật như α-keratin, ß-keratin.
Xét về cấu trúc không gian, đặc tính làm keratin trở nên rắn chắc phụ thuộc vào sự tập hợp cấu trúc siêu phân tử (thành phần và trình tự các amino acid của những mạch polypeptide thành phần). Sự phối hợp của các cấu trúc α–helix, ß-sheet và cầu nối disulfide sẽ quyết định cấu tạo của những protein chức năng, một vài trong số đó điều khiển tính không hoà tan.
Xét về thành phần hóa học, keratin chứa một tỷ lệ cao glycine và một tỷ lệ tương đối cao alanine.
Xét về liên kết hóa học, ngoài những liên kết hydro trong phân tử và giữa các phân tử, keratin còn có một lượng lớn sulfur trong các amino acid cysteine, được liên kết với nhau bởi những cầu nối disulfide. Nối disulfide nhiều tạo nên tính không hòa
tan của keratin, ngoại trừ các tác nhân phân hủy hay tác nhân khử như urea có thể hòa tan keratin. Keratin của lông có ít cầu nối disulfide hơn keratin ở móng hay guốc của động vật có vú. Do đó, móng, guốc cứng hơn so với lông. Trong trường hợp cấu hình ß-sheet, keratin được liên kết bởi những liên kết hydrogen tự do trong không gian giữa nhóm amino và nhóm carboxyl của những chuỗi peptide, tạo ra những liên kết dày đặc và chắc chắn. Phân tử keratin dạng sợi có thể bện xung quanh nhau tạo thành dạng sợi trung gian xoắn.
2.1.4. Các liên kết trong lông
2.1.4.1. Cấu trúc cuộn xoắn A
Trong cấu tạo của lông có 3 chuỗi xoắn α bện với nhau tạo thành dạng protofibril. Đây là cấu trúc sợi đầu tiên của lông. Chín protofibril được bó trong một vòng tạo thành microfibril. Những microfibril này được gắn vào một chất nền protein vô tổ chức amphorous chứa nhiều lưu huỳnh. Hàng trăm microfibril được gắn vào nhau tạo thành một bó sợi không đều nhau gọi là macrofibril. Những macrofibril này tập trung thành từng nhóm tạo nên lớp vỏ của lông. Những tế bào chết xung quanh cấu
trúc này tạo nên lớp sừng của lông. Ở phần trung tâm của lông có ống tủy là hệ thống lưu trữ và bài tiết các chất cặn bã, những kim loại nặng do cơ thể loại thải ra và chúng được bài tiết qua các ống.
2.1.4.2 Liên kết trong protein keratin
Cấu hình đầu tiên của lông được thiết lập trong không gian là bởi những liên kết được tìm thấy trong lớp vỏ của lông. Như chúng ta đã thấy ở phần trước, keratin bắt đầu với xoắn alpha tạo nên protofibril, microfibril, macrofibril và sau đó tạo nên
lớp vỏ. Những liên kết trong lông được nằm trong phạm vi một hay nhiều xoắn alpha.
2.1.4.3. Liên kết hydrogen
Liên kết này nằm giữa những cuộn tròn của xoắn alpha và có vai trò làm cho lông có khả năng duỗi ra rồi trở lại trạng thái cũ (tính đàn hồi). Liên kết hydrogen cho phép chúng ta tạm thời thay đổi hình dạng của lông với sự trợ giúp của nước. Những
liên kết này khi bị điện phân sẽ dễ dàng bị bẻ gãy và sữa đổi. Liên kết hydrogen đóng vai trò trong 35% tính bền và 50% tính đàn hồi của lông (có một vài tranh luận cho rằng nó đóng vai trò trong 99,9% tính đàn hồi của lông).
2.1.4.4. Liên kết muối
Liên kết muối là một dạng liên kết ion (điều khiển sự điện phân) bởi electron chuyển từ nhóm amino bazơ (amino acid với nhóm –COO) sang nhóm amino axit (amino acid với nhóm –NH3+ ). Điều này xảy ra ở vị trí song song với đường trục của
đường xoắn luân phiên. Liên kết muối đóng vai trò trong 35% tính bền và 50% tính đàn hồi của lông.
2.1.4.5. Liên kết cystine
Liên kết cystine được biết là liên kết disulfide, liên kết sulfur, liên kết -S được tạo ra bởi những liên kết chéo giữa các cystine của chuỗi polypeptide. Liên kết này thẳng góc với trục lông và nằm giữa những mạch polypeptide. Do vị trí của nó trong lông, liên kết cystine giữ vai trò trong tính dai của lông và chống lại sự mài mòn lông.
Liên kết này cho phép nếp tóc uốn giữ được lâu.
2.1.4.6. Liên kết đường
Liên kết đường nằm giữa amino acid có nhóm –OH và nhóm amino axit. Liên kết này thẳng góc với trục lông. Do vị trí của nó, liên kết đường đóng vai trò trong tính dai nhưng không giữ vai trò trong tính bền (5%). Sự ẩm ướt ở lông là do một loại sản
phẩm phụ của loại liên kết này.
2.1.5. Chu kỳ phát triển của lông
Chu kỳ phát triển của lông chia làm 3 pha: pha anagen (pha phát triển), pha catagen (pha chuyển tiếp) và pha telogen (pha nghỉ). Stenn và Paus (2001; dẫn liệu từ McNevin và cs, 2005) thêm vào pha thứ tư là exogen (pha rụng), cho phép nhìn thấy việc điều khiển di truyền bên trong nang lông.
Pha anagen là pha dài nhất trong chu kỳ phát triển lông ở người, từ 2-4 năm. Xấp xỉ 75-95% tất cả nang lông trên bề mặt da người là ở pha anagen. Pha catagen (2-3 tuần) được đánh dấu bởi sự kết thúc của quá trình phân bào nguyên nhiễm ở tế bào mầm nang lông. Trong pha telogen (3 tháng) chương trình chết của tế bào (apotosis) dẫn đến sự keratin hóa protein và sự hoại tử. Pha telogen có thể được kích động bởi tác động của các proteinase lên hành lông còn sống.
Ngay khi lông thoát ra khỏi nang lông, những tế bào bị mất nước, protein bị keratin hóa và liên kết chéo qua các cầu nối cystine disulfide. Lông bị keratin hóa chứa thấp hơn 10% nước. Quá trình keratin hóa gây ra sự thoái hóa tế bào và tiếp theo đó là sự mất DNA nhân ở lớp vỏ. Sử dụng nucleotide đánh dấu phóng xạ, Downes và cs (1966) chỉ ra rằng sự phân rã DNA xảy ra trong suốt quá trình keratin hóa. Chương trình chết của tế bào (apotosis) được mô tả bởi sự biến mất của những bào quan trong tế bào, và sự bẻ gãy những mạch đôi của DNA nhân bởi các deoxyribonuclease đặc biệt ở vùng liên kết giữa các nucleosome. Dạng tác động này của nuclease đưa đến kết quả là tạo ra các đoạn DNA <200 bp bao xung quanh các protein histone.
Poinar (2003) xác nhận rằng nuclease tác động là nhân tố chính trong sự suy thoái của DNA của những mô khảo cổ và những mô giám định pháp y. Kanesshige và cs (1992) nhận thấy rằng DNA ly trích từ móng tay - một loại mô bị keratin hóa tương tự lông, gồm những đoạn nhỏ hơn DNA ly trích từ máu. Đáng chú ý hơn, họ thấy rằng lượng DNA từ móng để phản ứng PCR thành công thì thấp hơn lượng DNA từ máu, điều này đưa ra giả thuyết rằng móng chứa ít yếu tố ức chế PCR (hemoglobin trong máu được biết là một yếu tố ức chế).
2.2. Những công trình tách chiết DNA từ lông
2.2.1. Những công trình tách chiết DNA từ lông ở nước ngoài
Việc sử dụng DNA từ nguồn lông không còn là mới lạ đối với các nước tiên tiến có ngành công nghệ sinh học phát triển. Có rất nhiều công trình nghiên cứu về khảo cổ, về khoa học hình sự, về y học, sử dụng nguồn DNA tách chiết từ mẫu lông
hay tóc. Có thể kể một số nghiên cứu tiêu biểu như dưới đây.
Baumgartner (1979) tiến hành thí nghiệm trên mẫu lông thú và xác định được khả năng lạm dụng thuốc của thú. Mặt khác, từ phân tích mẫu lông đã xác định được hàm lượng heroin trong cơ thể.
Kalbe và cs (1988) đã phân lập DNA dài 20.000 bp từ thân tóc và chỉ ra rằng nó tập trung hầu hết ở các tế bào lớp sừng bên ngoài thân tóc. Ông đã báo cáo năng suất ly trích DNA của 1 g lông là từ 20 ng -> 2 µg (0,02 - 2 ng/mg).
Schreiber và cs (1988) nhận ra rằng việc rửa SDS lặp lại nhiều lần làm giảm năng suất DNA thu hồi từ thân lông. Ông đã thu được 1µg DNA từ 200 mg lông (5 ng/mg).
Nozawa và cs (1999) ly trích DNA từ thân tóc với phương pháp kết tủa bằng CTAB. Sau đó, vùng đặc biệt của gen HLA-DQA1 được khuếch đại bằng phương pháp semi-nested PCR. Sản phẩm khuếch đại được tạo dòng và giải trình tự. Trình tự di truyền của HLA-DQA1 được xác định bằng cách so sánh trình tự với trình tự đã được biết trước của mỗi allele. Tất cả kiểu gen của HLA-DQA1 được phân loại thành công với mẫu thân tóc lấy từ 6 người khác nhau.
Heywood và cs (2003) đo được 1 ng DNA/ml thân tóc sau quá trình ly trích hữu cơ. DNA hiện diện ở cả phần gốc tóc (trung bình là 1,3 0,8 ng/ml) và phần ngọn tóc (trung bình là 0,3 0,6 ng/ml). Nhuộm huỳnh quang đã khám phá ra rằng DNA tóc cũng định vị ở lớp sừng. Họ thấy rằng nhuộm màu và dùng dầu gội lâu dài làm giảm lượng DNA ở lông. Chất peroxide trong màu nhuộm được biết là tác động mạnh đến DNA và kích thích hoạt động của những melanin có khả năng hoà tan trong nước. Đây là những melanin làm ức chế DNA polymerase. Ngược lại, Huhne và cs (1999) thấy rằng màu nhuộm và dầu gội không ảnh hưởng đến tỷ lệ thành công của việc ly trích và khuyếch đại DNA ty thể từ lông.
Một số bộ kit ly trích DNA từ nguồn mẫu bị keratin hóa như lông, móng, sừng, cũng đã được thương mại hóa rộng rãi trên thị trường. Các bộ kit này cung cấp một phương pháp đơn giản và nhanh chóng để ly trích và phân lập DNA mẫu lông. Có
thể tham khảo một số bộ kit sau:
* Hãng Sigma đưa ra sản phẩm REDExtract-N-AmpTMTissue PCR Kit dùng cho 10 phản ứng ly trích DNA từ mẫu lông hoặc mẫu nước bọt, mẫu mô động vật. Giá sản phẩm là 52,88 SGD. Đặc điểm của sản phẩm là có thể ly trích DNA từ mẫu chỉ
trong vòng 15 phút, có hiệu quả cao trong việc phân lập DNA của bộ gen và có thể ứng dụng cho nhiều loại mẫu.
* Hãng Bionex đưa ra sản phẩm MX-16. Đây là một thiết bị dùng ly trích và tinh sạch DNA, RNA và các vật liệu sinh học khác thông qua một quá trình tự động.
Có thể xử lý 16 mẫu cùng lúc. Thời gian quy trình là 35 phút. Thiết bị có thể áp dụng đối với mẫu tóc, lông, mô động vật, mẫu cây.
* Hãng Thistle đưa ra sản phẩm Gen-IAL 50 DNA Extractions Kit với giá là 90 £ có thể ly trích DNA trọng lượng phân tử lớn từ nhiều cơ chất khác nhau: lông, máu, xương, răng. DNA ly trích được có thể sử dụng cho PCR, Southern blot, giải trình tự và tạo dòng.
* Công ty DNA Testing Centre-INC ly trích mẫu thân lông với giá 240 USD; mẫu răng hay xương với giá 480 USD. DNA ly trích được có thể sử dụng theo nhiều hướng khác nhau tùy theo mục đích.
Đối với những phòng thí nghiệm quy mô nhỏ thì việc sử dụng những bộ kit được thương mại hoá trên thị trường thường không phù hợp vì giá thành cao. Vì vậy, tùy theo mục đích thí nghiệm mà chúng ta sẽ sử dụng quy trình ly trích hay bộ kit có
sẵn trên thị trường.
2.2.2. Những công trình tách chiết DNA từ lông ở trong nước
Ở nước ta, việc tách chiết DNA từ mẫu lông chưa được phổ biến. Việc tìm ra một quy trình ly trích DNA từ mẫu lông phù hợp với điều kiện hóa chất và thiết bị ở Việt Nam đang là một vấn đề đối với các nhà khoa học trong nước. Nguyễn Văn Út (2005) đã tiến hành tách chiết DNA trên mẫu lông và đưa ra kết luận rằng DNA ly trích từ cơ khá tinh sạch và có hàm lượng cao hơn so với DNA ly trích từ lông; DNA ly trích từ gốc lông có độ tinh sạch cao hơn so với DNA ly trích từ ngọn lông.
Bùi Thị Ngọc Bích (2006) đã sử dụng một số hoá chất để cải thiện hiệu quả quy trình ly trích DNA từ lông và đưa ra kết quả như sau: DTT và CTAB trong dung dịch đệm ly trích đã cải thiện tỷ số OD nhưng chỉ cho sản phẩm PCR ngắn (370 bp)
của gen giới tính và không có sản phẩm PCR của gen halothane. Bổ sung BSA vào hỗn hợp PCR cũng không cải thiện được kết quả PCR.
2.3. Phản ứng PCR (polymerase chain reaction)
2.3.1 Nguyên tắc cơ bản của phản ứng PCR
Phản ứng PCR là phản ứng nhân bản (khuếch đại) DNA nhờ polymerase do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985.
Theo Gerard Morel và cs (1998), phương pháp PCR sử dụng những trình tự DNA ngắn như đoạn mồi (oligonucleotides), một DNA polymerase chịu nhiệt (ví dụ Taq polymerase) (Sake và ctv, 1985; Haase và ctv, 1990), và tri–photphat deoxyribonucleotides (dNTPs): dATP, dGTP, dTTP, dCTP. Sau bước tách hai mạch của trình tự đích (thông thường do gia nhiệt ở 95o C trong 5 phút), đoạn mồi bắt cặp
hay lai với trình tự đích trong bước thứ hai.
Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kì nối tiếp nhau, được thực hiện theo nguyên lý sau:
- Bước đầu tiên của PCR là biến tính (denaturation) mẫu DNA thành chuỗi đơn bằng nhiệt độ cao 94 – 950 C.
- Sau đó nhiệt độ phản ứng được hạ thấp đến 45 – 600 C. Ở nhiệt độ này, primer (mồi- oligonucleotide tổng hợp mà chuỗi của chúng được cho lai với chuỗi đối nghịch của mẫu DNA) bắt cặp với vùng bổ sung trên đoạn mẫu DNA. Đây là giai đoạn ủ bắt cặp (annealing).
- Hỗn hợp được tăng nhiệt độ lên 720 C. Khi đó, sự hiện diện của deoxyribonucleotide triphosphate (dATP, dCTP, dTTP, dGTP) và Taq polymease, các oligonucleotide được kéo dài tạo nên chuỗi DNA. Các trình tự này tạo thành một chu kỳ gồm 3 giai đoạn: biến tính (94 – 950 C), ủ bắt cặp (45 – 600 C) và kéo dài (720 C). Trong khuếch đại DNA, chu kỳ này sẽ được lặp
lại nhiều lần.
2.3.2. Những thành phần tham gia vào phản ứng PCR
- Taq polymerase: là DNA polymerase chịu nhiệt được tách chiết từ vi khuẩn suối nước nóng Thermus aquaticus. Taq polymerase không bị phá huỷ ở nhiệt độ biến tính và xúc tác sự tổng hợp DNA theo chiều 5' – 3' trong suốt quá trình phản ứng dưới sự hiện diện của Mg2+
- Primer (đoạn mồi): là những đoạn oligonucleotide mạch đơn, có trình tự bổ sung với trình tự base của hai đầu mạch khuôn để khởi đầu quá trình tổng hợp DNA.
Chiều dài primer tối thiểu cho hầu hết các phản ứng PCR là 18 nucleotide (thường – 24 nucleotide). Đối với việc khuếch đại các chuỗi có mức độ dị hợp cao, primer được sử dụng có 28 – 35 nucleotide.
- Các nucleotide (dNTPs): là hỗn hợp 4 loại dATP, dCTP, dTTP, dGTP làm nguyên liệu cho phản ứng tổng hợp DNA. Bốn loại này thường được sử dung ở nồng độ 20 – 200 µM mỗi nucleotide. Sự mất cân bằng trong thành phần các nucleotide làm
tăng các lỗi sao chép của polymerase (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1988).
- Dung dịch đệm: quan trọng nhất là ion Mg2+
. Mg2+ rất cần cho quá trình liên kết các dNTPs, xúc tác cho enzyme Taq polymerase, làm tăng nhiệt độ nóng chảy của DNA mạch kép. Dung dịch đệm tiêu chuẩn chứa 50 mM KCl và khuếch đại tốt những đoạn DNA > 500 bp.
- DNA mẫu: được tách chiết từ mẫu xét nghiệm. Việc xác định hàm lượng DNA để bổ sung primer là rất cần thiết. Nếu tỷ lệ primer : DNA mẫu quá cao sẽ dẫn đến hiện tượng primer – dimers. Nếu tỷ lệ này thấp thì sẽ có ít sản phẩm PCR (Bùi Chí
Bửu, 1999).
2.4. Gen halothane
2.4.1. Khái quát về gen halothane
Gen halothane (Hal) xuất hiện ngẫu nhiên trong quá trình chọn lọc heo nhiều nạc và được phát hiện vào năm 1980 bằng phương pháp ngửi chất gây mê halothane.
Đây là gen gồm 2 alen (N và n) nằm trên nhiễm sắc thể số 6, gây nên hội chứng nhạy cảm stress và chi phối đến các tính trạng về tăng trưởng, phẩm chất quày thịt và phẩm chất thịt. Phương pháp trắc nghiệm halothane chỉ phát hiện được kiểu gen NN và nn.
Heo nhạy cảm stress (kiểu gen nn) có ưu điểm là dày mỡ lưng thấp, tỷ lệ nạc cao, hệ số chuyển hóa thức ăn tốt nhưng có nhược điểm là thành tích sinh sản kém, tăng tỷ lệ thịt PSE (tái, mềm, rỉ dịch) và tăng tỷ lệ chết do vận chuyển (Nguyễn Ngọc Tuân và Trần Thị Dân, 2000).
Gen halothane gồm 2 alen N và n tạo nên 3 kiểu gen NN, Nn, nn. Nhóm heo mang kiểu gen NN và Nn không nhạy cảm với halothane (HAL-), trong khi nhóm heo mang kiểu gen nn thì nhạy cảm với halothane (HAL+) (Whittemore, 1993).
Gen halothane mặc dù tác động có lợi đến tỷ lệ nạc một cách có ý nghĩa nhưng cũng có ảnh hưởng xấu như làm thú tăng trưởng kém, tỷ lệ đột tử cao trong quá trình nuôi dưỡng và vận chuyển đến lò mổ, tỷ lệ quầy thịt PSE nhiều, số con sơ sinh trên ổ thấp (Gahre và Juneja, 1985).
Về mặt cấu trúc, sự khác biệt giữa kiểu gen đồng hợp trội NN và kiểu gen đồng hợp lặn nn là sự đột biến C (cytosine) thành T (thymine) tại vị trí base 1843. Sự đột biến này có liên quan đến hội chứng sốt kiệt phát trên nhóm heo nhạy cảm với stress (Fujii và ctv, 1991). Về mặt di truyền, gen halothane di truyền theo định luật Mendel.
Để phát hiện những cá thể nhạy cảm với stress, người ta cho heo ngửi chất gây mê bay hơi halothane trong 3 - 5 phút với nồng độ từ 4 - 8%. Thú được ngửi halothane đến khi phản xạ mắt biến mất trong phút đầu tiên và tình trạng mê duy trì khoảng phút. Khi các chi của heo duỗi thẳng và cứng đơ thì phản ứng halothane dương tính (HP) hoặc nhạy cảm với stress. Ngược lại, khi thú vẫn dãn cơ bình thường thì phản ứng halothane âm tính (HN) hoặc đề kháng với stress.
Hầu hết các dòng Yorkshire Large White có tần số nhạy cảm rất thấp hoặc bằng không. Pietrain và Landrace Bỉ có tần số nhạy cảm cao nhất. Các dòng Landrace khác có tần số nhạy cảm stress trung gian giữa Yorkshire và Pietrain (Trích dẫn
Nguyễn Ngọc Tuân, 1996).
Trắc nghiệm ngửi chất gây mê halothane có lợi trong thực tế vì rẻ tiền nhưng phát hiện trễ (heo trên 8 tuần tuổi), cồng kềnh, tốn công và không thể phát hiện kiểu gen Nn. Ngoài ra, heo có thể chết đột ngột do sốt kiệt phát lúc xét nghiệm. Do vậy, cần
tìm ra một biện pháp xét nghiệm thay thế có hiệu quả hơn.
2.4.2. Ảnh hưởng của gen halothane
2.4.2.1. Ảnh hưởng của gen halothane đến năng suất sinh sản Ảnh hưởng của gen halothane đến năng suất sinh sản là một vấn đề rất được quan tâm vì sinh sản là yếu tố quyết định cho sự tăng đàn, phát triển về số lượng.
Trên nọc, stress làm giảm tính dục, số lượng tinh trùng thấp. Do đó, số lượng tinh trùng bình thường có khả năng thụ tinh sẽ giảm. Những nọc nhạy cảm với stress (có kiểu gen nn) có phẩm chất tinh dịch thấp hơn so với nọc mang gen NN và Nn
(Pfeiffer và ctv, 1986).
Trên nái, stress làm cho nái mang thai mệt mỏi, kém ăn, . gây ảnh hưởng xấu đến quá trình sinh sản như giảm số trứng rụng, tăng hiện tượng chết phôi, ảnh hưởng đến số con đẻ ra trên mỗi lứa.
Theo Schneider và ctv (1980), nái HAL- đẻ nhiều con hơn nái HAL+ từ 0,11 đến 1 con trên ổ, thể hiện rõ qua tỷ lệ số con cai sữa so với số heo con sinh ra. Theo Willeke và ctv (1984), ảnh hưởng của gen halothane không có ý nghĩa trên số con đẻ
ra và số con còn sống/ổ nhưng lại ảnh hưởng có ý nghĩa đến số lứa đẻ của nái. Điều này cho thấy gen halothane đã ảnh hưởng lên năng suất sinh sản của heo nái.
2.4.2.2. Ảnh hưởng của gen halothane đến sinh trưởng và phẩm chất thịt
Đối với sinh trưởng, stress làm heo còi cọc, sút cân và tăng trưởng chậm. Một phần do con vật chán ăn, mặt khác do cơ thể sản xuất ra một lượng lớn hormone glucocorticoid. Khi có phản ứng stress mạnh, cơ thể sẽ sử dụng nguồn năng lượng dự
trữ để thích nghi. Vì vậy, nếu quá trình này kéo dài sẽ dẫn đến giảm tăng trọng trên thú nhỏ và mất thể trọng trên thú nuôi thịt và sản xuất.
Heo mang kiểu hình HP có mức tăng trọng thấp nhưng lượng tiêu thụ thức ăn giảm và hệ số chuyển hoá thức ăn tốt hơn so với kiểu heo mang kiểu hình HN. Bên cạnh đó ưu điểm nổi bật của những heo này là diện tích thịt thăn, tỷ lệ nạc và tỷ lệ thịt
xẻ cao, dày mỡ lưng thấp, chiều dài quầy thịt giảm, xương nhỏ. Cùng với những lợi điểm này thì tỷ lệ thịt PSE cũng tăng cao trên cá thể HP, làm giảm chất lượng thịt.
Qua kết quả nghiên cứu của Webb và ctv (1981) và nhiều tác giả cho thấy heo đồng hợp tử lặn nn cho tỷ lệ thịt xẻ, tỷ lệ nạc, diện tích thịt thăn lớn hơn và dày mỡ lưng thấp hơn heo mang kiểu gen NN và Nn. Song, tỷ lệ thịt PSE cao nhất ở heo mang
kiểu gen nn. Tổng hợp những tính trạng này, các tác giả cho rằng gen Nn mang tính trạng trung gian giữa kiểu gen NN và nn nên mang lại lợi ích kinh tế cao hơn so với kiểu gen NN, nn.
Như vậy bên cạnh những ưu điểm của gen halothane là những ảnh hưởng không nhỏ lên sự sinh trưởng, sinh sản và phẩm chất thịt. Có nhiều ý kiến cho rằng cần phải loại thải gen này trong đàn giống để giảm hội chứng stress và thịt PSE. Nhưng ngược lại cũng có nhiều đề xuất giữ lại gen này ở dạng dị hợp tử Nn để tận dụng tính ưu việt về tỷ lệ nạc và tính kháng stress. Tuy nhiên, tùy theo mục đích khác nhau mà nhà chọn giống có nhiều lựa chọn để có hiệu quả kinh tế cao nhất.
2.5. Những công trình nghiên cứu về halothane
2.5.1 Nguyên tắc xác định gen halothane
Gen halothane có hai alen N và n hình thành 3 kiểu gen NN, Nn và nn. Bằng việc so sánh trình tự nucleotide của gen này, MacLennan thấy rằng có sự đột biến C (cytosin) thành T (thymin) ở vị trí base 1843 của chuỗi nucleotide. Fujii và ctv (1991)
đã đưa ra phương pháp phát hiện gen halothane bằng kỹ thuật PCR và enzyme cắt giới 15 hạn Hha I để phát hiện đột biến điểm trên bất kỳ loại tế bào nào có chứa DNA. Sau đó, kỹ thuật này được Hughes và ctv (1992) cải tiến. Phương pháp này phân biệt dễ dàng các kiểu gen NN, Nn và nn (Nguyễn Thị Thu Phương, 2004).
2.5.2. Những công trình nghiên cứu halothane ở trong nước
Theo Nguyễn Ngọc Tuân (1996), tần số nhạy cảm với halothane khác nhau giữa các quốc gia. Hầu hết các dòng Yorkshire Large White có tần số nhạy cảm rất thấp hoặc bằng không, Pietrain và Landrace Bỉ có tần số nhạy cảm cao nhất, các dòng Landrace khác có tần số nhạy cảm stress trung gian giữa Yorkshire và Pietrain.
Kết quả nghiên cứu của Đinh Văn Chỉnh và ctv (1999) cho rằng heo nái Landrace và Yorkshire, kiểu gen halothane có ảnh hưởng đến các chỉ tiêu sinh sản, nhất là các chỉ tiêu về độ lớn của lứa đẻ và qua đó ảnh hưởng đến khối lượng của toàn ổ.
Theo Nguyễn Ngọc Tuân và Trần Thị Dân (2000), với kiểu gen nn, nọc có sức sản xuất tinh kém nhất, nái có thời gian chờ phối dài hơn và số con sơ sinh/ổ kém hơn so với 2 kiểu gen NN và Nn. Heo Nn có tăng trọng và dày mỡ lưng trung gian giữa
NN và nn.
Phan Xuân Hảo (2001) cho rằng kiểu gen halothane ảnh hưởng rõ rệt đối với chỉ tiêu số con/ổ ở nái Landrace, có ảnh hưởng nhưng không rõ rệt đối với nái Yorkshire.
2.5.3 Những công trình nghiên cứu halothane ở nước ngoài
Kết quả nghiên cứu của Webb và ctv (1981) và nhiều tác giả (Pommier và cs, 1992; Wittmann và ctv, 1993; Berger và cs, 1994) cho thấy heo đồng hợp tử lặn nn cho tỷ lệ thịt xẻ, tỷ lệ nạc, diện tích thịt thăn lớn hơn và dày mỡ lưng thấp hơn heo
mang kiểu gen NN, Nn. Song tỷ lệ thịt PSE cao nhất ở heo mang kiểu gen nn. Tổng hợp những tính trạng này các tác giả nhận định rằng kiểu gen Nn mang tính trạng trung gian giữa kiểu gen NN và nn nên đem lại lợi ích kinh tế cao hơn kiểu gen NN, nn.
Kết quả nghiên cứu của Webb và Jordan (1978); Schneider và ctv (1980); Willeke và ctv (1984) cho rằng nái không nhạy cảm với halothane (NN, Nn) đẻ nhiều hơn so với nái nhạy cảm với halothane (nn) từ 0,1 – 1,1 con/ổ, sự khác biệt thể hiện rõ
số con cai sữa hơn là số con sinh ra. Trong suốt đời nái, nái có kiểu gen NN, Nn đẻ 16 nhiều hơn nái có kiểu gen nn 1,02 lứa (Willeke, 1986). Lengerken và ctv (1982) cho biết lợn có phản ứng halothane âm tính có thành tích cao hơn so với lợn có phản ứng halothane dương tính về tổng số con đẻ ra/ổ (0,3 con), số con đẻ ra có khả năng chăn nuôi/ổ (0,9 con) và số lứa đẻ/năm (0,17 lứa).
Bằng những công trình nghiên cứu của các tác giả trong và ngoài nước cho thấy rằng gen halothane đã có ảnh hưởng lớn đến năng suất sinh sản và chất lượng thịt. Vì vậy, việc nghiên cứu tính nhạy cảm stress nói chung và tính năng sản xuất của heo có các kiểu gen halothane khác nhau nói riêng đã được tiến hành từ những năm 70 cho đến nay vẫn là một vấn đề rất được quan tâm.

PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

5.1. Kết luận
- Sử dụng buffer ly trích chứa proteinase K ở các nồng độ 0,8 mg/ml, 1 mg/ml và 1,2 mg/ml đều cho chất lượng DNA tốt với tỷ số OD từ 1,75 – 1,84.
- DNA được ly trích với DTT ở nồng độ 50 mM khá tinh sạch (OD = 1,65) và thành công khi được dùng làm nguồn mẫu cho phản ứng PCR.
- Sử dụng CTAB 0,2% cho DNA tinh sạch (tỷ số OD trung bình là 1,80) và phản ứng PCR khuếch đại được gen halothan ở nồng độ này.
- Vị trí gốc lông cho DNA ly trích tinh sạch nhất (OD = 2,05), tiếp theo là vị trí thân lông (OD = 1,84), cả sợi lông (OD = 1,75),vị trí ngọn lông (OD = 1,4). Phản ứng PCR khuếch đại gen halothane cho tỷ lệ thành công cao nhất đối với mẫu gốc lông
(70%), tiếp theo là mẫu thân lông (60%) và cả sợi lông (50%). Phản ứng PCR không thành công đối với mẫu ngọn lông.
5.2. Đề nghị
- Tiếp tục cải thiện quy trình ly trích DNA từ lông để cho hiệu suất PCR cao nhất.
- Sử dụng thân lông (đoạn 1 cm kể từ da thú trở lên) dùng làm nguyên liệu ly trích DNA.
- Áp dụng quy trình ly trích DNA từ lông này lên các loài thú khác nhau, kể cả với lông người trong những lĩnh vực có liên quan.
MỤC LỤC
PHẦN I. MỞ ĐẦU 1
1.1. Đặt vấn đề . 1
1.2. Mục tiêu và yêu cầu 2
1.2.1. Mục tiêu . 2
1.2.2. Yêu cầu 2
PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 3
2.1. Cấu trúc của lông 3
2.1.1. Cấu trúc tổng quan . 3
2.1.2. Cấu trúc của melanin . 4
2.1.3. Cấu trúc của keratin . 4
2.1.4. Các liên kết trong lông 5
2.1.4.1. Liên kết cuộn xoắn A . 5
2.1.4.2. Liên kết trong protein keratin . 6
2.1.4.3. Liên kết hydrogen . 6
2.1.4.4. Liên kết muối 6
2.1.4.5. Liên kết cystine . 6
2.1.4.6. Liên kết đường 6
2.1.5. Chu kỳ phát triển của lông heo 6
2.2. Những công trình tách chiết DNA từ lông . 7
2.2.1. Những công trình tách chiết DNA từ lông ở nước ngoài . 7
2.2.2. Những công trình tách chiết DNA từ lông ở trong nước 9
2.3. Phản ứng PCR (polymerase chain reaction) . 10
2.3.1. Nguyên tắc cơ bản của PCR 10
2.3.2. Những thành phần tham gia vào phản ứng PCR . 10
2.4. Gen halothane . 11
2.4.1. Khái quát về gen halothane . 11
2.4.2. Ảnh hưởng của gen halothane . 12
2.4.2.1. Ảnh hưởng của gen halothane đến năng suất sinh sản . 12
2.4.2.2. Ảnh hưởng của gen halothane đến sinh trưởng và phẩm chất thịt . 13
2.5. Những công trình nghiên cứu về halothane . . 13
2.5.1. Nguyên tắc xác định gen halothane . 13
2.5.2. Những công trình nghiên cứu halothane ở nước ngoài . 14
2.5.3. Những công trình nghiên cứu halothane trong nước . 14
PHẦN III. NỘI DUNG VÀ PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16
3.1. Nội dung nghiên cứu 16
3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành 16
3.3. Vật liệu . 16
3.3.1. Nguồn mẫu chiết xuất DNA 16
3.3.2. Đoạn mồi . 16
3.3.3. Hóa chất . 16
3.3.4. Dụng cụ và thiết bị dùng trong đề tài 17
3.3.4.1. Dụng cụ . 17
3.3.4.2. Thiết bị 17
3.4. Phương pháp tiến hành . 18
3.4.1. Lấy và trữ mẫu . 18
3.4.2. Tách chiết DNA . 19
3.4.2.1. Thiết lập quy trình ly trích DNA từ lông heo 19
3.4.2.2. Áp dụng quy trình ly trích DNA lên các vị trí khác nhau của lông heo 20
3.4.3. Định lượng DNA bằng quang phổ kế 21
3.4.4. Thực hiện phản ứng PCR 21
3.4.5. Điện di và quan sát kết quả 22
3.4.5.1. Chuẩn bị gel agarose . 22
3.4.5.2. Đọc kết quả 22
3.5. Xử lý số liệu . 22
PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 23
4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ proteinase K . 23
4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát nồng độ DTT 26
4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát nồng độ CTAB . 27
4.4. Thí nghiệm 4: Áp dụng quy trình ly trích DNA lên các vị trí lông heo . 29
PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 30
5.1. Kết luận . 30
5.2. Đề nghị . 30
VI. TÀI LIỆU THAM KHẢO . 31