Luận Văn Quy trình chẩn đoán viêm gan bằng kỹ thuật PCR Elisa và Real - time PCR

LỜI MỞ ĐẦU
Hiện nay, người ta ước tính có khoảng hơn phân nửa dân số trên thế giới
đã từng bị nhiễm một hoặc nhiều siêu vi gây viêm gan từ siêu vi A đến siêu vi G.
Nhiễm siêu vi A và E chỉ gây ra bệnh lý cấp tính và diễn tiến bệnh thường tự
giới hạn, ít để lại hậu quả nghiêm trọng. Ngược lại, viêm gan siêu vi B, C và D
có thể dẫn đến những nhiễm trùng dai dẳng mãn tính với nguy cơ tiến triển sang
xơ gan, ung thư gan và đưa đến tử vong. Hơn nữa, tỉ lệ mắc bệnh viêm gan siêu
vi B và C nhanh chóng gia tăng ở nhiều quốc gia đã làm cho bệnh này trở thành
một vấn đề đáng được quan tâm cho sức khoẻ cộng đồng.
Siêu vi viêm gan C là một trong những bệnh nguy hiểm rất đáng lo ngại
hiện nay, bởi số lượng người nhiễm bệnh, cũng như các kiểu biến chứng gây
nguy hiểm đến sức khỏe con người như xơ gan, ung thư thư gan Ở Việt Nam,
bệnh này mới xuất hiện gần đây nên chúng ta chưa hiểu rõ được nguyên nhân
gây ra bệnh và cũng chưa biết cách phòng ngừa nhiều nên chúng ta sẽ dễ dàng
mắc phải. Viêm gan siêu vi C xâm nhập vào cơ thể nhờ virus HCV (Hepatitis C
Virus), được Houghton phát hiện vào năm 1989. Từ đó, nhờ vào những thử
nghiệm tìm anti-HCV, tỉ lệ người bị nhiễm viên gan sau truyền máu đã giảm đi
đáng kể. Trong suốt thập niên 90 của thế kỷ 20, các nhà khoa học đã đạt được
nhiều thành tựu mới trong lãnh vực nghiên cứu cấu trúc phân tử của siêu vi và
đặc biệt là trong điều trị. Hiện này những phương thức trị liệu siêu vi C mặc dù
chưa phải là hoàn hảo nhưng càng ngày càng có những thuốc mới hơn và hiệu
quả cao hơn được đưa vào thử nghiệm lâm sàng. Khả năng thường xuyên biến
đổi cấu trúc di truyền của siêu vi C đã trở thành một thách thức lớn cho việc chế
tạo thuốc chủng ngừa trong tương lai. Cho nên, nếu ta phát hiện bệnh viêm gan
siêu vi C này càng sớm càng tốt thì ta sẽ biết được nhiễm genotype C nào, để tìm
ra loại thuốc điều trị tốt.
Để phát hiện ra dòng virus này thì nhiều nhà khoa hoc đã nghiên cứu ra
nhiều phương pháp phát hiện virus HCV dựa vào các ứng dụng của sinh học
2
phân tử như : phương pháp ELISA kết hợp với phương pháp PCR, phương pháp
lai phân tử (Hybrid Capture, bDNA ) .và gần đây nhất là phương phát Real-
Time PCR là phương pháp được sử dụng nhiều nhất hiện nay vì phương pháp
này, thao tác dễ thực hiện, ít gây sai sót, cho kết quả trong thời gian ngắn, và
định tính một cách chính xác, độ nhạy cao hơn kỹ thuật bDNA và phương pháp
xác định bệnh nhân có bị nhiễm viêm gan lại hay không, vì các phương pháp
khác chỉ xác định được bệnh nhân có bị nhiễm cấp tính hay mãn tính do không
phân biệt chắc chắn được tình trạng đang nhiễm hay đã lành (hết mầm bệnh
trong cơ thể, không còn nguy cơ lây lan), ví dụ : phương pháp PCR ELISA, sau
khi điều trị bệnh đã hết, có nghĩa là kháng nguyên lạ đã không còn, nhưng kháng
thể vẫn còn tồn tại trong cơ thể một thời gian dài, có khi đến nhiều năm
Do đó, việc chẩn đoán viêm gan C là một trong những nhu cầu cần thiết
đối với con người. Cho nên, em chọn đề tài này để tìm hiểu quy trình chẩn đoán
bệnh viên gan siêu vi C bằng phương pháp Real-Time PCR và phương pháp
PCR ELISA là hai phương pháp thông dụng nhất hiện nay.
3
CHƯƠNG1. TỔNG QUAN VỀ BỆNH VIÊM GAN SIÊU VI C
1.1 Lịch sử phát hiện bệnh [7]
Bệnh viêm gan siêu vi C do Hepatitis C Virus (HCV) gây ra. Đây là một
bệnh nguy hiểm, thường dẫn đến các biến chứng như xơ gan và ung thư gan
nguyên phát với tỉ lệ cao. Hiện nay, số người nhiễm HCV trên thế giới ước tính
khoảng 170 triệu người (số liệu năm 2000).
Quá trình phát hiện bệnh viêm gan siêu vi C:
Năm 1975, Prince và cộng sự nhận định rằng có một chứng bệnh viêm
gan siêu vi sau truyền máu không do HBV và có thời kỳ ủ bệnh dài hơn thời ủ
bệnh do HAV. Sau đó, các tác giả khác chứng minh về mặt huyết thanh học rằng
bệnh viêm gan siêu vi loại này không có liên quan gì đến bệnh viêm gan siêu vi
A và từ lúc này danh từ “bệnh viêm gan siêu vi không A không B” ra đời.
Vào tháng 5 năm 1989, có một phát hiện mới về viêm gan siêu vi không A
không B được công bố. Bằng phương pháp ly tâm siêu tốc huyết tương thu từ
những con tinh tinh bị bệnh viêm gan siêu vi, Choo và cộng sự đã tách chiết
nucleic acid của virus, tổng hợp cDNA từ RNA tách chiết, chèn vào genome (bộ
gene) của λgt11 và xâm nhiễm E. coli. Trong số hàng triệu dòng thu được có một
dòng có phản ứng đặc hiệu với kháng thể có trong huyết thanh người bị bệnh
viêm gan siêu vi không A không B sau truyền máu. Cuối cùng, họ xác định rằng
bệnh viêm gan siêu vi không A không B do một loại siêu vi mới gây ra, đó là
siêu vi C (HCV).
1.2. Đặc điểm của virus gây bệnh viêm gan siêu vi C: [1, tr. 8-12], [20]
1.2.1 Đặc điểm sinh học của virus HCV
HCV là virus thuộc họ Flaviviridae. Đây là một loại virus RNA, có vỏ
lipid, đường kính khoảng 55-65 nm. Trọng lượng phân tử khoảng 4.106 daltons.
Bộ gen (genome) của siêu vi là một chuỗi đơn RNA có cực tính (+), nằm bên
4
trong phần nucleocapsid hình đa diện. Ở ngoài cùng là lớp vỏ lipid chứa các
protein E1 và E2 tạo thành các phức hợp dimer ( Hính1.1).
Điểm đặc biệt ở virus này là chưa có một nghiên cứu nào có thể xác định
cấu trúc chính xác của virus. Cho đến nay, các nhà khoa học chỉ thiết lập nên
một mô hình mang tính chất mô phỏng cấu trúc của virus này. Nguyên nhân của
việc này là do HCV không thể gây nhiễm nhân tạo trên các dòng tế bào hiện có
trên các phòng thí nghiệm trên thế giới (không phân lập được virus mà chỉ tách
được gen di truyền ( acid nhân ) trong huyết tương người bị nhiễm HCV RNA).
Đây chính là một trong những trở ngại lớn trong việc tìm hiểu cặn kẽ về virus
này.
Mật độ các hạt tử của virus HCV trong huyết thanh rất thay đổi, từ 1,03
đến 1,72g/ml. Sở dĩ có sự thay đổi này là do các virion lưu hành trong máu dưới
nhiều dạng khác nhau : hoặc là ở dạng tự do có tính lây nhiễm rất cao nhưng chỉ
hiện diên ở mật độ tương đối thấp ( khoảng 1,03 ) hoặc là ở dạng kết hợp với các
đại phân tử đặc biệt là các lipoprotein hoặc hiện diện trong các phức hợp miễn
dịch nhưng mật độ lại cao (khoảng 1,10). Thực nghiệm trên khỉ chimpanzee cho
thấy tính lây nhiễm của HCV tự do cao hơn rõ rệt so với dạng kết hợp với các
đại phân tử. Một điểm quan trọng nữa là virus này có khả năng biến thể nhanh và
tạo thành rất nhiều type và sub-type kháng thuốc.
Chính vì khả năng biến thể quá nhanh này mà cho đến nay vẫn chưa có
một loại vaccine nào có hiệu quả đối với HCV.