Luận Văn Phát triển các fluorescent ATP sensor, sử dụng tiểu đơn vị Epsilon của phân tử F1-ATPase/synthase và

TÓM TẮT KHOÁ LUẬN

Đề tài “Phát triển các fluorescent ATP sensor, sử dụng tiểu đơn vị Epsilon của phân tử F1-ATPase/synthase và các biến thể của green fluorescent protein” được thực hiện tại phòng thí nghiệm của Giáo sư Noji Hiroyuki, Institute of Scientific and Industrial Research (ISIR), Đại học Osaka, Nhật Bản; thời gian từ tháng 10 năm 2006 đến tháng 8 năm 2007. Trong đề tài này, các ATeam là phức hợp của CFP nối với tiểu đơn vị từ Escherichia coli (EF1), Bacillus clausii (BCL), Bacillus megaterium (BME), Bacillus pseudofirmus (BPF) và monomeric Venus hoặc các circular permutated Venus, được tạo ra bằng kỹ thuật sinh học phân tử. Theo kết quả đánh giá các cấu trúc này in vitro, BME có ái lực với ATP ở mức millimole. Trong khi đó, BCL và BPF có ái lực với ATP trong khoảng vài trăm micromole. Tuy nhiên, ATeam với EF1 và BPF có đáp ứng rất thấp với ATP. Nồng độ ATP trong tế bào được cho là nằm trong khoảng dưới millimole đến vài millimole nên các ATeam với BME và BCL có thể được sử dụng để xác định nồng độ ATP trong tế bào sống. Trong số các ATeam từ BME thì ATeam BME-cp173Venus là ATP sensor tốt nhất. ATeam này có hằng số phân ly đối với ATP và Hill coefficient lần lượt là K’d = 3,36 và n = 2.04. ATeam BCL-nVenus có hằng số phân ly đối với ATP K’d = 4,12.105 và Hill coefficient n = 2,2. Song, ATeam này luôn tồn tại dưới hai dạng: đơn phân tử và đa phân tử. Dạng đa phân tử có ái lực rất thấp với ATP. Để loại bỏ hiện tượng đa phân tử, các đột biến thay thế amino acid trong phân tử BCL như I9T/V42K/F67N/L78N, P85A, I9T/V42K/F67N/L78N/P85A đã được thử nghiệm nhưng không hiệu quả. Qua các kết quả đạt được, ATeam BME-cp173Venus là sensor có thể được sử dụng để chỉ thị nồng độ ATP trong tế bào sống ở mức millimole. Đối với các ATeam từ BCL, cần nghiên cứu thêm để giải quyết vấn đề về sự kết dính của protein.

Chương 1. MỞ ĐẦU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục đích và yêu cầu 2
1.2.1. Mục đích 2
1.2.2. Yêu cầu 3
Chương 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
Chương 3. VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 7
3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện khoá luận 7
3.2. Vật liệu 7
3.3. Phương pháp thí nghiệm 8
3.2.1. Cấu trúc gen 8
3.2.1.1. Tiểu đơn vị epsilon ( ) của F0F1-ATP synthase 8
3.2.1.2. Protein huỳnh quang màu vàng (Venus9
3.2.1.3. Cấu trúc chung của các ATeam 10
3.2.1.4. Nhóm ATeam với EF1 12
3.2.1.5. Nhóm ATeam với BME 13
3.2.1.6. Nhóm ATeam với BCL 14
3.2.1.7. ATeam BPF -nVenus 16
3.2.2. Kiểm tra cấu trúc của các ATeam 16
3.2.2.1. Nhóm ATeam với monomeric Venus (nVenus) 16
3.2.2.2. Nhóm ATeam với cpVenus 18
3.2.3. Biểu hiện và tinh sạch protein tái tổ hợp 18
3.2.4. Đánh giá các ATeam in vitro 21
3.2.4.1. Đo quang phổ huỳnh quang của ATeam 20
3.2.4.2. Đo timecourse của ATeam 22
3.2.4.3. Công thức tính dynamic range 22
3.2.4.4. Công thức tính hằng số phân ly 22
3.2.4.5. Công thức tính tốc độ đáp ứng với ATP của ATeam 23
Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24
4.1. Kết quả thí nghiệm 24
4.1.1. Nhóm ATeam EF1 -nVenus và ATeam EF1 -cpVenus 24
4.1.2. Kết quả sắc ký lọc gel của ATeam BME-nVenus, BCL-nVenus, BPF-nVenus 26
4.1.3. Nhóm ATeam BME-nVenus và ATeam BME-cpVenus 27
4.1.5. ATeam BPF-nVenus 32
4.1.6. Nhóm ATeam với BCL 33
4.2. Thảo luận 42
Chương 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 45
Chương 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO 48
​