Luận Văn Phát triển các fluorescent atp sensor sử dụng tiểu đơn vị epsilon của phân tử f1 -atpase/synthase và

MỤC LỤC


Trang


Lời cảm tạ--------------------------------------------------------------------------------iii


Tóm tắt khoá luận-----------------------------------------------------------------------iv


Abstract ---------------------------------------------------------------------------------- v


Mục lục-----------------------------------------------------------------------------------vi


Danh sách các chữ viết tắt ------------------------------------------------------------viii


Danh sách các bảng--------------------------------------------------------------------- x


Danh sách các hình --------------------------------------------------------------------- x


Chương 1. MỞ ĐẦU ------------------------------------------------------------------- 1


1.1. Đặt vấn đề---------------------------------------------------------------------- 1


1.2. Mục đích và yêu cầu---------------------------------------------------------- 2


1.2.1. Mục đích --------------------------------------------------------------------- 2


1.2.2. Yêu cầu----------------------------------------------------------------------- 3


Chương 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ------------------------------------------------ 4


Chương 3. VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM -------------------- 7


3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện khoá luận -------------------------------- 7


3.2. Vật liệu ------------------------------------------------------------------------- 7


3.3. Phương pháp thí nghiệm ----------------------------------------------------- 8


3.2.1. Cấu trúc gen ----------------------------------------------------------------- 8


3.2.1.1. Tiểu đơn vị epsilon ( ) của F F -ATP synthase----------------------- 8

0 1


3.2.1.2. Protein huỳnh quang màu vàng (Venus)------------------------------- 9


3.2.1.3. Cấu trúc chung của các ATeam ---------------------------------------- 10


3.2.1.4. Nhóm ATeam với EF1 ------------------------------------------------- 12


3.2.1.5. Nhóm ATeam với BME ----------------------------------------------- 13


3.2.1.6. Nhóm ATeam với BCL ----------------------------------------------- 14


3.2.1.7. ATeam BPF -nVenus---------------------------------------------------- 16


3.2.2. Kiểm tra cấu trúc của các ATeam---------------------------------------- 16


3.2.2.1. Nhóm ATeam với monomeric Venus (nVenus) ---------------------- 16


3.2.2.2. Nhóm ATeam với cpVenus --------------------------------------------- 18


3.2.3. Biểu hiện và tinh sạch protein tái tổ hợp ------------------------------- 18


3.2.4. Đánh giá các ATeam in vitro --------------------------------------------- 21


3.2.4.1. Đo quang phổ huỳnh quang của ATeam------------------------------ 20


3.2.4.2. Đo timecourse của ATeam---------------------------------------------- 22


3.2.4.3. Công thức tính dynamic range----------------------------------------- 22


3.2.4.4. Công thức tính hằng số phân ly --------------------------------------- 22


3.2.4.5. Công thức tính tốc độ đáp ứng với ATP của ATeam ---------------- 23


Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ------------------------------------------ 24


4.1. Kết quả thí nghiệm----------------------------------------------------------- 24


4.1.1. Nhóm ATeam EF1 -nVenus và ATeam EF1 -cpVenus --------------- 24


4.1.2. Kết quả sắc ký lọc gel của ATeam BME-nVenus,


BCL-nVenus, BPF-nVenus ----------------------------------------------- 26


4.1.3. Nhóm ATeam BME-nVenus và ATeam BME-cpVenus--------------- 27


4.1.5. ATeam BPF-nVenus ------------------------------------------------------- 32


4.1.6. Nhóm ATeam với BCL -------------------------------------------------- 33


4.2. Thảo luận---------------------------------------------------------------------- 42


Chương 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ --------------------------------------------- 45


Chương 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO ---------------------------------------------- 48


DANH SÁCH CÁC BẢNG


BẢNG TRANG


Bảng 4.1 Bảng so sánh dynamic range của nhóm ATeam EF1-nVenus


và ATeam EF1-cpVenus ------------------------------------------------- 24


Bảng 4.2 Bảng so sánh dynamic range của nhóm ATeam BME-nVenus


và ATeam BME-cpVenus ------------------------------------------------ 29


DANH SÁCH CÁC HÌNH


HÌNH TRANG


Hình 2.1 Sơ đồ cấu trúc của Cameleons và hiệu ứng FRET giữa


hai phân tử GFP khi Ca2+ kết hợp vào calmodulin --------------------- 5


Hình 3.1 A. Sơ đồ cấu trúc của ATP synthase -------------------------------------- 9


B. Cấu trúc tinh thể của TF - khi gắn với ATP

1


Hình 3.2 Cấu trúc tinh thể của monomeric Venus--------------------------------- 10


Hình 3.3 Sơ đồ cấu trúc chung của các ATeam với nVenus và cp Venus ------ 11


Hình 3.4 Sơ đồ vector pCEV1-EF -------------------------------------------------- 12

1


Hình 3.5 Sơ đồ vector pRSET-AT1.20---------------------------------------------- 13


Hình 3.6 Các mồi được thiết kế để gây đột biến gen BCL -------------------- 17


Hình 3.7 Nuôi cấy E.coli XL10 trên môi trường thạch LB,


0.1 mg/ml Ampicillin------------------------------------------------------ 17

Hình 3.8 Kết quả điện di trên gel agarose của pRSET-BCL


(I9T/V42K/F67N/L78N)- cpVenus, cắt bởi ClaI và PstI. ------------- 18


Hình 3.9 Nuôi cấy E.coli JM109 (DE3) trên môi trường thạch LB,


0.1 mg/ml Ampicillin------------------------------------------------------ 20


Hình 3.10 Protein ATeam thu được sau khi tinh sạch bằng sắc ký lọc gel----- 21


Hình 4.1 Quang phổ huỳnh quang của nhóm ATeam với EF1 ở các


nồng độ khác nhau của ATP---------------------------------------------- 25


Hình 4.2 So sánh kết quả sắc ký lọc gel của ATeam BME-nVenus,


ATeam BCL-nVenus, ATeam BPF-nVneus ---------------------------- 27


Hình 4.3 Kết quả Native-PAGE của ATeam BCL-nVenus và


ATeam BPF-nVenus ------------------------------------------------------- 28


Hình 4.4 Kết quả sắc ký lọc gel của BCL-nVenus (1)


và BCL-nVenus (2) -------------------------------------------------------- 28


Hình 4.5 Quang phổ huỳnh quang của nhóm ATeam với BME ở


những nồng độ khác nhau của MgATP --------------------------------- 30


Hình 4.6 Kết quả đo time-course của ATeam BME-cp173Venus ở


các nồng độ xác định của MgATP--------------------------------------- 31


Hình 4.7 Đường cong chuẩn độ với MgATP của ATeam BME-cp173Venus-- 32


Hình 4.8 Quang phổ huỳnh quang của ATeam BPF-nVenus--------------------- 33


Hình 4.9 Quang phổ huỳnh quang của ATeam BCL-nVenus -------------------- 34


Hình 4.10 Đường cong chuẩn độ với MgATP của ATeam BCL-nVenus------- 34


Hình 4.11 So sánh đường cong chuẩn độ với MgATP của


ATeam BCL-nVenus (1) và BCL-nVenus (2) ------------------------ 35