Thạc Sĩ Phát hiện và xác định Klebsiella pneumoniae mang gen BLAKPC kháng CARBAPENEM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
năm 2011

MỤC LỤC ( Luận văn dài 107 trang chỉ 1 file duy nhất)


MỤC LỤC . i
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v
DANH MỤC HÌNH . vi
DANH MỤC BẢNG viii
ĐẶT VẤN ĐỀ . 1


1. TỒNG QUAN . 3
1.1 Vi khuẩn Klebsiella pneumoniae 3
1.1.1 Đặc điểm phân loại 3
1.1.2 Đặc điểm hình thái, sinh hóa và phân bố 4
1.1.3 Các nhân tố gây bệnh . 7
1.1.4 Đặc điểm gây bệnh và tình hình đề kháng kháng sinh 8
1.2 Carbapenem và cơ chế kháng carbapenem 9
1.2.1 Carbapenem . 9
1.2.2 Cơ chế kháng carbapenem 11
1.2.3 Carbapenemase . 12
1.3 Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC) 15
1.3.1 Klebsiella pneumonia carbapenemase (KPC) . 15
1.3.2 Phát hiện và điều trị nhiễm khuẩn kháng carbapenem . 17
1.3.3 Tình hình dịch tễ học 19
1.4 Một số nghiên cứu đã thực hiện 23
1.4.1 Trên thế giới . 23
1.4.2 Trong nước 25


2. VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP . 27
2.1 Vật liệu . 27
2.1.1 Các chủng thí nghiệm 27
2.1.2 Thiết bị 27
2.1.3 Hóa chất 28
2.2 Phương pháp . 28
2.2.1 Phương pháp nhuộm gram . 29
2.2.2 Phương pháp định danh sinh hóa . 29
2.2.2.1 Nguyên tắc các phản ứng sinh hóa định danh nhóm trực khuẩn Gram âm 30
2.2.2.2 Cách tiến hành . 33
2.2.3 Phương pháp giải trình tự gen 16S RNA 36
2.2.3.1 Tách chiết DNA vi khuẩn . 37
2.2.3.2 Phản ứng PCR khuyếch đại đoạn gen 16S rRNA . 37
2.2.3.3 Tinh sạch sản phẩm PCR 38
2.2.3.4 Xác định nồng độ DNA sau tinh sạch . 40
2.2.3.5 PCR giải trình tự . 40
2.2.3.6 Tủa và tinh sạch sản phẩm PCR giải trình tự . 41
2.2.3.7 Điện di mao quản DNA . 42
2.2.3.8 Xử lý kết quả giải trình tự . 42
2.2.4 Phương pháp phát hiện vi khuẩn có kiểu hình tiết ESBL 42
2.2.4.1 Phương pháp đĩa đôi . 42
2.2.4.2 Phương pháp đĩa kết hợp 43
2.2.5 Phương pháp phát hiện vi khuẩn có khả năng sinh carbapenmase 44
2.2.5.1 Phương pháp khuyếch tán kháng sinh . 45
2.2.5.2 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC 45
2.2.5.3 Thử nghiệm Hodge cải biên 45
2.2.5 Phương pháp xác định vi khuẩn mang gen blaKPC . 47
2.2.5.1 Phương pháp PCR 47
2.2.5.2 Điện di gel agarose . 48
2.2.5.3 Phương pháp giải trình tự gen . 49
2.2.5.4 Xác định kiểu gen blaKPC 50
2.3 Qui trình thí nghiệm . 51


3. KẾT QUẢ BIỆN LUẬN . . 53
3.1 Kết quả định danh vi khuẩn 53
3.1.1 Kết quả định danh sinh hóa . 53
3.1.2 Kết quả giải trình tự 16S rRNA . 56
3.2 Kiểm tra kiểu hình tiết ESBL 57
3.3. Kiểm tra kiểu hình kháng carbapenem 59
3.3.1 Biện luận tính kháng dựa vào đường kính vòng vô khuẩn . 59
3.3.2 Biện luận tính kháng dựa vào MIC . 61
3.3.3 Kết quả thử nghiệm Hodge cải biên 64
3.4. Xác định gen blaKPC . 68
3.4.1. Kết quả PCR 683.4.2 Kết quả giải trình tự . 71
3.4.3 Xác định kiểu gen blaKPC . 76
3.5 Tổng kết kết quả thu được 79
3.5.1 Đánh giá tính kháng của các chủng thí nghiệm 79
3.5.2 Đánh giá thử nghiệm Hodge cải biên . 81


4. KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ . 83
4.1 Kết luận 83
4.2 Đề nghị . 84


TÀI LIỆU THAM KHẢO. . 85
Tài liệu tiếng Việt . 85
Tài liệu tiếng Anh . 86
Tài liệu Internet 93

PHỤ LỤC
Phu lục 1: Kết quả định danh bằng IDS 14 ® GNR
Phu lục 2: Kết quả giải trình tự gen 16S rRNA
Phu lục 3: Hình ảnh kháng sinh đồ của 21 chủng thí nghiệm
Phu lục 4: Kết quả giải trình tự gen blaKPC của các chủng thí nghiệm




DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1 Một số thử nghiệm sinh hóa của các loài chi Klebsiella 5
Bảng 1.2 Nguồn phân lập Klebsiella 6
Bảng 1.3 Phân lớp các kháng sinh beta-lactam .10
Bảng 1.4 Các men beta-lactamase chọn lọc ở vi khuẩn gram âm 12
Bảng 1.5 Phân bố của gen blaKPC theo thời gian và vùng địa lý 21
Bảng 2.1 Hướng dẫn đọc kết quả các phản ứng sinh hóa trong bộ IDS14 GNR® 35
Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rRNA 38
Bảng 2.3 Hướng dẫn biện luận tính kháng của nhóm Enterobacteriacea theo CLSI 2011
Bảng 2.4 Trình tự mồi sử dụng khuyếch đại gen blaKPC .47
Bảng 2.5 Chương trình luân nhiệt Tm55 và Tm60 .48
Bảng 2.6 Tên và nồng độ kháng sinh trong kháng sinh đồ 52
Bảng 3.1 Kết quả định danh bằng bộ hóa chất IDS14 GNR® 54
Bảng 3.2 Nồng độ, kích thước sản phẩm PCR gen 16S rRNA sau tinh sạch .56
Bảng 3.3 Kết quả xác định các chủng tiết ESBL 58
Bảng 3.4 Kết quả biện luận tính kháng carbapenem dựa vào đường kính vòng vô
khuẩn quanh đĩa carbapenem 60
Bảng 3.5 So sánh kết quả biện luận tính kháng carbapenem dựa vào MIC và dựa vào đường kính vòng vô khuẩn
Bảng 3.6 Bảng tổng kết kết quả thu được .67
Bảng 3.7 Nồng độ và kích thước sản phẩm PCR gen KPC sau tinh sạch 72
Bảng 3.8 Đánh giá kết quả thử nghiệm Hodge cải biên (MHT) 81


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1 Hình kính hiển vi quét của khuẩn lạc K. pneumoniae . 4
Hình 1.2 Cấu trúc của penicillin và carbapenem . 9
Hình 1.3 Vị trí của gen blaKPC ở K. pneumoniae và một số loài khác 16
Hình 1.4 Sự khác biệt giữa KPC-1, KPC-2 và KPC-3 17
Hình 1.5 Phân bố dịch tễ gen blaKPC (năm 2009) . 23
Hình 2.1 Hướng dẫn định danh vi khuẩn gram âm dễ mọc nhờ bộ IDS14 GNR® 36
Hình 2.2 Thử nghiệm Hodge cải biên trên môi trường MHA . 46
Hình 2.3 Sơ đồ đặt các đĩa kháng sinh . 52
Hình 3.1 Kết quả nuôi cấy và quan sát trên kính hiển vi điện tử . 53
Hình 3.2 Hình ảnh điện di chip gen 16S rRNA 56
Hình 3.3 Kết quả kháng sinh đồ chủng 17 59
Hình 3.4 Kết quả xác định MIC meropenem bằng phương pháp vi pha loãng trong
môi trường lỏng của chủng 04, 05, 13, 18, 20. 62
Hình 3.5 Kết quả thử nghiệm Hodge cải biên (MHT) . 65
Hình 3.6 Kết quả điện di sản phẩm PCR khuyếch đại gen KPCu và KPC của chủng chứng âm và chứng dương 68
Hình 3.7 Kết quả điện di gen KPC và KPCu của 21 chủng thí nghiệm 70
Hình 3.8 Kết quả điện đi chip sản phẩm PCR gen blaKPC tinh sạch 72
Hình 3.9 Kết quả giải trình tự gen blaKPC của chủng K. pneumoniae ATCC ®
1705 với cặp mồi blaKPC-F . 74
Hình 3.10 Kết quả giải trình tự gen blaKPC của chủng K. pneumoniae ATCC ®
1705 với cặp mồi blaKPC-R . 74



DANH MỤC HÌNH
Hình 3.11 Kết quả tra cứu trình tự tương đồng với chủng K. pneumoniae ATCC ®
1705 dùng trong thí nghiệm bằng công cụ BLAST của NCBI 75
Hình 3.12 Tìm vị trí cắt giới hạn trong trình tự gen blaKPC bằng phần mềm Primer premier 5.0 . 77



ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong cuộc chiến tranh giữa con người và vi khuẩn, kháng sinh là những trợ thủ đắc lực cho con người. Thuốc kháng sinh không ngừng được cải biến về chất lượng và phổ tác dụng nhằm tăng cường hiệu quả điều trị. Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh rộng rãi đã dẫn tới sự gia tăng các chủng vi khuẩn đa kháng thuốc với nhiều cơ chế khác nhau, đáng chú ý là cơ chế sản xuất men ESBL (extended spectrum beta-lactamase) có khả năng thủy phân các thế hệ kháng sinh cephalosporin và hầu hết các loại beta-lactam. Đối với các trường hợp này, kháng
sinh carbapenem được xem là phương án cuối cùng. Vũ khí carbapenem hiện nay đang có nguy cơ trở nên vô hiệu do sự xuất hiện của các vi khuẩn có khả năng tiết men carbapenemase, đáng lo ngại nhất là men KPC (Klebsiella pneumoniae Carbapenemase) phát hiện chủ yếu ở Klebsiella pneumoniae.


Klebsiella pneumoniae được biết đến là tác nhân phổ biến các trường hợp viêm phổi bệnh viện và nhiều bệnh nhiễm trùng nguy hiểm khác. Chủng này có khả năng tích lũy và lan truyền tính kháng rất cao. Gần đây, vi khuẩn Klebsiella pneumoniae mang gen blaKPC kháng carbapenem đã và đang bùng phát trên một số quốc gia trên thế giới và gây ra những đợt dịch lớn điển hình như ở New
York[17, 18, 20, 69], Isarel [46]. Đây thực sự là thách thức đối các nhà điều trị và gánh nặng cho cộng đồng bởi vì việc trị liệu rất hạn chế, những vi khuẩn mang gen này được xem là “bất trị”. Hơn nữa, gen blaKPC nằm trên plasmid nên khả năng lan truyền tính kháng rất nhanh và còn có thể cộng hợp với các họ gen kháng khác trên plamid làm cho những chủng mang gen này có tính kháng mạnh hơn. Tổ chức Y tế thế giới đã lên tiếng cảnh báo về sự lây lan của các vi khuẩn Klebsiella pneumoniae mang gen blaKPC để các nước có biện pháp kiểm soát sự lây nhiễm và tránh lạm dụng, sử dụng thuốc kháng sinh sai mục đích. Tuy nhiên, ở Việt Nam, cho đến nay vẫn chưa có nghiên cứu nào về mô hình lan truyền của siêu vi khuẩn này.

Đề tài “Phát hiện và xác định Klebsiella pneumoniae mang gen blaKPC kháng carbapenem” được thực hiện nhằm phát hiện được một số chủng Klebsiella pneumoniae mang gen blaKPC ở một số bệnh viện ở Việt Nam. Qua đó giúp cho các nhà lâm sàng Việt Nam kịp thời có biện pháp cách ly, ngăn chặn sự lây lan cũng như có cái nhìn thận trọng hơn về sự lan truyền của đối tượng này.


Nội dung thực hiện đề tài bao gồm các phần:
+ Định danh lại các chủng nghi ngờ là Klebsiella pneumoniae có tính đa kháng thu được từ một số bệnh viện tại Việt Nam.
+ Xác định kiểu hình tiết ESBL và carbapenemase.
+ Phát hiện gen blaKPC bằng phương pháp PCR.
+ Xác định kiểu gen blaKPC trên các chủng Klebsiella pneumoniae bằng phương pháp giải trình tự.