Luận Văn Phát hiện nhân tố gây bệnh (gene fimA) của vi khuẩn P.gingivalis bằng phương pháp real time PCR

MỤC LỤC

Trang
Phần 1. ĐẶT VẤN ĐỀ . i
PHẦN 2. TỔNG QUAN . 2
1. GIỚI THIỆU BỆNH VIÊM NHA CHU . 2
1.1 Bệnh viêm nha chu 2
Thành phần chính trong mảng bám gồm có: . 2
1.2 Các triệu chứng của bệnh như sau 3
1.3 Tác nhân gây bệnh 4
1.4 Ảnh hưởng của bệnh trên người 5
2. Tình hình bệnh viêm nha chu trên thế giới và tại Việt Nam . 6
2.1 Trên thế giới 6
2.2 Tại Việt Nam . 7
3. Vi khuẩn porphyromonas gingivalis . 7
3.1 Vi khuẩn Porphyromonas gingivalis 7
3.2 Phân loại khoa học [9] . 8
Giới: Eubacteria 8
3.3 Cấu trúc bộ gene 8
3.4. Giới thiệu Gene fimA . 9
3.5. Giới thiệu gene 16s rRNA 9
4. Cơ chế gây bệnh viêm nha chu: . 10
5. Các phương pháp phát hiện bệnh viêm nha chu . 12
5.1. Phương pháp nuôi cấy 13
5.2 Phương pháp lai DNA-DNA (checkboard DNA-DNA hybridisation) . 13
5.3 Phương pháp PCR và realtime PCR . 13
6. Phương pháp realtime PCR và ứng dụng 14
6.1 Định nghĩa . 14
6.2 Nguyên tắc 14
6.3 Các bước cơ bản của một chu kỳ nhân gene . 14
6.4. Các thành phần và ảnh hưởng của chúng tới hiệu quả các phản ứng real time
PCR: 16
6.4.1. DNA mẫu (DNA template) . 16
6.4.2 Primer và nhiệt độ lai 16
6.4.3 Enzyme . 16
6.4.4. Các thành phần khác . 16
a. Nồng độ dNTP (các deoxynucleotide triphotphat) . 16
b. Nồng độ MgCl2 . 17
c. Dung dịch đệm 17
6.5 Ưu điểm của Real-time PCR . 17
6.6 Vấn đề hạn chế đối với Real-time PCR 17
PHẦN 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP . 18
1. Vật liệu . 18
1.1 Mẫu . . 18
1.2 Primer và probe . 18
1.3 Hóa chất xử lý và tách chiết mẫu 19
1.4 Hóa chất phản ứng real time PCR . 19
1.5 Thiết bị và dụng cụ 19
2. Phương pháp . . 20
2.1 Phương pháp thiết kế, đánh giá primer và probe 20
2.1.1 Tiêu chuẩn primer và probe . 20
2.1.2 Phương pháp thiết kế primer và probe . 21
2.1.3 Phương pháp đánh giá primer và probe . 21
1.2. Phương pháp đánh giá độ đặc hiệu của primer trên lý thuyết 21
2.3 Phương pháp tách chiết DNA . 22
2.4 Phương pháp real time PCR 23
2.5 Phương pháp khảo sát nhiệt độ lai của hệ primer-probe . 24
2.6 Phương pháp khảo sát độ đặc hiệu của hệ primer-probe 25

2.7 Phương pháp khảo sát độ nhạy của quy trình 25
PHẦN 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27
1. Kết quả thiết kế primer/probe 27
2. Kết quả khảo sát các đặc tính của mồi . 32
3. Kết quả khảo sát tính đặc hiệu và khả năng nhân bản chọn lọc của mồi trên lý
thuyết . 34
4. Kết quả xây dựng quy trình realtime PCR 38
4.1. Kết quả khảo sát khả năng hoạt động của primer/probe. . 38
4.2. Kết quả chạy multiplex realtime PCR với tỷ lệ mỗi primer/probe là 1:1:1:1:1 . 40
4.3. Kết quả khảo sát nhiệt độ lai tối ưu . . 42
4.4. Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của qui trình 44
4.5. Kết quả khảo sát độ nhạy của quy trình . 46
4.6. Kết quả ứng dụng quy trình trên mẫu bệnh phẩm 49
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 588
1. KẾT LUẬN . 58
2. ĐỀ NGHỊ 58