Thạc Sĩ Phân tích tính đa hình của trình tự 16S RNA, Cytochrome b ty thể và mối quan hệ phát sinh loài của H

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
Chuyên ngành: Di truyền học
LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC
năm 2012

Mục lục
Phụ bìa
Lời cảm ơn
Mục lục . i
Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt ii
Danh mục bảng . iii
Danh mục hình iv
Mở đầu . 1


Chương 1: Tổng quan tài liệu
1.1. Giới thiệu về heo rừng 3
1.2. Tiến hóa phân tử và phát sinh loài phân tử 7
1.3. Khái niệm loài 8
1.4. Các khái niệm về phát sinh loài 9
1.5. Một số marker phân tử 15
1.6. Các nghiên cứu về quan hệ phát sinh loài phân tử của heo rừng 21
Chương 2: Vật liệu – Phương pháp
2.1. Vật liệu . 24
2.2. Phương pháp . 27


Chương 3: Kết quả ‒ Biện luận
3.1. Mối quan hệ phát sinh loài dựa trên trình tự gen cytochrome b . 35
3.2. Mối quan hệ phát sinh loài dựa trên trình tự 16S . 44
3.3. Xây dựng cây phát sinh loài dựa trên mối quan hệ với gen cytochrome b và gen 16S . 53
Kết luận 57
Danh mục công trình của tác giả 58
Tài liệu tham khảo . 59
Phụ lục


Danh mục bảng
Bảng 1: Một số thiết bị sử dụng trong đề tài 24
Bảng 2: Một số dụng cụ sử dụng trong đề tài 25
Bảng 3: Một số hóa chất sử dụng trong đề tài . 26
Bảng 4: Địa điểm thu nhận mẫu heo rừng . 28
Bảng 5: Trình tự mồi sử dụng trong PCR và giải trình tự 32
Bảng 6: Nhiệt độ phản ứng của các đoạn mồi . 33
Bảng 7: Vùng phân bố các cá thể heo rừng Việt Nam khu vực Tây Nguyên dùng trong phân tích trình tự cytochrome b . 36
Bảng 8: Thông tin trình tự cytochrome b của cá thể heo rừng nước ngoài dùng trong phân tích . . 37
Bảng 9: Mức độ tương đồng vùng trình tự gen cytochrome b và chuỗi polypeptide cytochrome b ở một số loài động vật 41
Bảng 10: Vùng phân bố các cá thể heo rừng Việt Nam dùng trong phân tích trình tự 16S . 45
Bảng 11: Thông tin trình tự 16S của cá thể heo rừng nước ngoài dùng trong phân tích . 46
Bảng 12: Mức độ tương đồng vùng trình tự gen 16S ở một số loài động vật 50
Bảng 13: Mã số các cá thể heo rừng nước ngoài được sử dụng trong so sánh trình tự
kết hợp gen cytochrome b và 16S . 53
Bảng 14: Khoảng cách di truyền giữa các nhóm heo rừng 54
Bảng 15: Khoảng cách di truyền trung bình giữa các cá thể trong các nhóm heo rừng 55



Danh mục hình
Hình 1: Heo rừng trong môi trường tự nhiên . 5
Hình 2: Heo rừng khi còn non . 7
Hình 3: Phân loại cây phát sinh loài theo Page và Holmes (1998) 10
Hình 4: Những mối quan hệ giữa loài tổ tiên và loài hiện tại 12
Hình 5: Cấu trúc DNA ty thể của người . 16
Hình 6: Cấu trúc của protein cytochrome b . 18
Hình 7: Cấu trúc vùng kiểm soát của ty thể ở động vật có vú. 19
Hình 8: Một số thiết bị sử dụng . 24
Hình 9: Một số dụng cụ sử dụng 25
Hình 10: Kit PureLinkTM Spin Column 26
Hình 11: Sơ đồ tóm tắt thí nghiệm . 27
Hình 12: Một cá thể heo rừng lai thu nhận ở khu vực Lâm Đồng 29
Hình 13: Sơ đồ tóm tắt quy trình tách chiết . 30
Hình 14: Hình đại diện kết quả khuếch đại vùng gen CY2 ở các mẫu heo rừng . 35
Hình 15: Vị trí các điểm đột biến và điểm đa hình trong vùng trình tự cytochrome b (1140 bp) ở các cá thể heo rừng . 39
Hình 16: Vùng trình tự polypeptide cytochrome b gồm 336 amino acid được dịch mã từ
đoạn gen cytochrome b dài 1140 bp 41
Hình 17: Cây phát sinh loài NJ (Neighbor‒Joining) mô tả mối quan hệ giữa các cá thể heo rừng Việt Nam, heo rừng lai, Hàn Quốc, Tây Ban Nha, Trung Quốc và Rumani dựa trên trình tự 1140 bp của gen cytochrome b 43
Hình 18: Hình đại diện kết quả khuếch đại vùng gen S1 ở các mẫu heo rừng 44
Hình 19: Vị trí các điểm đột biến và điểm đa hình trong vùng trình tự 16S (997 bp) ở các cá thể heo rừng . 48
Hình 20: Cây phát sinh loài NJ (Neighbor‒Joining) mô tả mối quan hệ giữa các cá thể
heo rừng Việt Nam, heo rừng lai, Hàn Quốc, Tây Ban Nha và Đài Loan dựa trên trình tự 997 bp của gen 16S 52
Hình 21: Cây phát sinh loài NJ (Neighbor‒Joining) mô tả mối quan hệ giữa các cá thể
heo rừng Việt Nam, heo lai Việt Nam, heo rừng Châu Âu, và heo rừng Châu Á dựa trên trình tự 2100 bp của gen cytochrome b và 16S 56




Mở đầu
Heo không những là vật nuôi quan trọng mang lại hiệu quả kinh tế cao mà còn là mô hình thí nghiệm trên người ở những nghiên cứu sinh hóa và y sinh. Trong đó, heo rừng (Sus scrofa) với nhiều tiềm năng mà con người vẫn chưa khám phá hết được. Việc nghiên cứu loài heo này còn ít được quan tâm và còn nhiều bỏ ngỏ. Định danh loài chính xác có vai trò quan trọng trong khoa học pháp y, an toàn thực phẩm và nhiều lĩnh vực khác. Ý tưởng sử dụng các trình tự DNA đặc hiệu loài để định danh loài đã được đưa ra trong những năm đầu thập niên 70. Việc giải toàn bộ trình tự DNA ty thể hoặc giải trình tự một số vùng trên DNA ty thể như vùng kiểm soát (J. Koji Lum, 2006), cytochrome b (Y. N. Jiang, 2008), giúp xác định những biến dị cũng như cây phát sinh loài giữa các loài heo bản địa trên thế giới, từ đó xác định được mức độ đa dạng cũng nguồn gốc của loài heo trên thế giới (E. Giuffra, 2000). Hiện nay một số nghiên cứu trên heo rừng thuần Việt Nam đã được tiến hành. Vùng D‒loop của DNA heo rừng của Việt Nam ở một số tỉnh miền Bắc đã được giải trình tự và xác định các biến dị giữa các loài heo bản địa cũng như so sánh loài heo Việt Nam với loài heo của Nhật Bản (Naotaka Ishiguro, 2008) hay việc sử dụng microsatellites để đánh giá so sánh tính đa hình cũng như mức độ đa dạng di truyền của một số loài heo rừng miền Bắc với châu Âu (N.T.D. Thuy, 2006). Tuy nhiên, các nghiên cứu sử dụng heo rừng khu vực miền Trung, miền Nam cũng như trình tự cytochrome b và 16S trong đánh giá biến dị và đa dạng di truyền vẫn chưa được quan tâm nghiên cứu đầy đủ.


Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành giải trình tự vùng cytochrome b và 16S của DNA ty thể heo rừng Việt Nam khu vực Tây Nguyên và phân tích điểm đa hình cũng như những khác biệt di truyền của heo rừng Việt Nam khu vực Tây Nguyên so với một số loài heo rừng các nước khác. Kết quả nghiên cứu này là cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo như bảo tồn hay sử dụng nguồn gen heo rừng Tây Nguyên.